熒光定量實驗報告

1、RT-qPCR比較不同樣本中 miR-21 的相對表達差異一、實驗目的1、掌握實時熒光定量 PCR的實驗原理。2、掌握實時熒光定量 PCR相對定量的分析方法。二、實驗原理實時熒光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR) 是一種在 DNA擴增反應 中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應 (PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過 內參或者外參法對待測樣品中的特定 DNA序列進行定量分析的方法。熒光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 結合染料 SYBR Green 的非特異性方法和 Taqman 水解探針的特異性方法。本實驗中采用非特異性 SYBR Green I 染料法

2、 ，SYBR Green I 是一種結合于所有 ds DNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料 ，在游離狀態(tài)下會發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結合后，熒光大大增強 。因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒 光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。三、實驗儀器、材料和試劑實驗儀器： PCR儀、熒光定量 PCR儀實驗材料： MCF7細胞實驗試劑：逆轉錄試劑盒、 SYBR GREE試N劑盒四、實驗步驟MCF7細胞 RNA提取( RNAiso Plus )1) 將生長至 80%的 MCF細胞消化為單細胞懸液，準備提取 RNA；2

3、) 9000g,2min 離心，棄掉培養(yǎng)基，加 1 ml RNAiso Plus 用移液槍反復吹吸直 至裂解液中無明顯沉淀，室溫( 15-30)靜置 5 分鐘；3) 加入氯仿( RNAiso Plus 的 1/5 體積量)，蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈 乳白色，室溫靜置 5min；4) 12,000 g 4 離心 15 分鐘。從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為 三層，即：無色的上清液(含 RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為 DNA)及 帶有顏色的下層有機相。5) 吸取上清液轉移至另一新的離心管中(切勿吸出白色中間層) 。6) 向上清中加入倍 RNAiso Plus 體積的異丙醇，上下

4、顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置 10 分鐘。7）12,000g 4 離心 10 分鐘。一般在離心后，試管底部會出現(xiàn) RNA沉淀。8）棄上清，加入 1ml DEPC水配制的 75%乙醇，充分洗滌管蓋和管壁，并輕彈管 底，讓沉淀浮起來，并靜置 3-5 min ；9）打開離心管蓋，室溫干燥沉淀幾分鐘。沉淀干燥后，加入適量 （ 可以根據(jù)沉 淀的多少確定）的 RNase-free 水溶解沉淀。 測濃度，記錄 A260/280。1% 瓊脂糖凝膠電泳（取少部分進行跑電泳，留足夠的量做反轉錄）反轉錄試劑體積（ 10l ）RNA500 ngGene specific primers(2 M) RT1lprim

5、er5×ReverseTranscriptase M -MLV2lBufferdNTP (10mM)lReverse Transcriptase M-MLVlInhibitor (40 U/ l)lRNase-Free WaterUp to 10l反應條件：溫度： 42， 45min;70 ， 15min.qPCR試劑體積（ 20l ）2×SYBR Green10lFP (10 l)lRP(10l)lcDNA Template1lRNase-free Water8l反應程序：1） stage 1 ：預變性， 95， 3min;2） Stage 2: 循環(huán)反應： 40 個循環(huán)

6、95， 10s;60， 30s3）溶解曲線： 95 ，15 s；60，1 min ；95 ，15 s.五實驗結果及分析RNA的質量檢測結果ng/ul260/280260/230擴增曲線：溶解曲線：如圖，為單一的峰，說明無非特異性產(chǎn)物，定量準確。實驗結果及數(shù)據(jù)處理PCR 反應結束后，得到如下數(shù)據(jù)：Sample NameTarget NameReporterCC MeanMCF7miR21SYBR16.16.MCF7miR21SYBR16.MCF7miR21SYBRMCF7miR-130bSYBR22.22.MCF7miR-130bSYBRMCF7miR-130bSYBR22.MCF7GAPDHS

7、YBR13.MCF7GAPDHSYBR13.MCF7GAPDHSYBR13.注：平行樣的 Ct 值之間的差 < 時表示重復性較好計算如下：CT(miR21)=CT(miR130b)=CT= CT(miR21) - CT(miR130b)miR21的表達量是 miR130b的倍六問題與思考1.設計本次實驗 miR-21和 miR-130b的 RT-qPCR引物？ miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA莖環(huán)引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACAF Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGA

8、TGTTG R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTAT（T通C 用引物） 引物 Blast 結果：miR130b：CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT莖環(huán)引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCC F Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCAR Primer: CGCAGGGTCCGAGGTA（TT通C用引物）引物 Blast 結果：2.熒光定量 PCR與普通 PCR有什么異同點？原理不同 ：熒光定量 PCR實時監(jiān)測與 DNA結合的熒光染料激發(fā)的熒光；普通 PCR 通過檢測插入 DNA中核酸染料的量來測定 PCR最終產(chǎn)物量，一般是紫外光。 反應要求不同： 熒光定量對擴增片段有較高的要求，一般為 100-300bp ；普通定 量可以擴增長點的片段。 如果不需要檢測產(chǎn)物