蛋白質(zhì)定量的五種方法

1、蛋白質(zhì)定量得五種方法方法一 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目得 掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度得原理與標(biāo)準(zhǔn)曲線得繪制。 原理 雙縮脲（ NH2CNHCOH2） 在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物 , 稱為雙縮脲反應(yīng)， 蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵 （ H ） 在堿性溶液中也能 與 Cu反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。 在一定范圍內(nèi) , 其顏色得深淺與蛋白質(zhì)濃度成正 比。因此 , 可以利用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。雙縮脲法就是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度得常用方法之一 . 操作簡(jiǎn)便、迅速、受蛋白 質(zhì)種類性質(zhì)得影響較小 , 但靈敏度較差，而且特異性不高 . 除CONH有此反應(yīng) 外， CN2、C22、-CSN2等基團(tuán)也有此反應(yīng)。 操作

2、取中試管 7 支，按下表操作各管混勻、放置37水浴中保溫 20分鐘.用50n比色, 以空白管調(diào)零點(diǎn) 讀取各管光密度值。 計(jì)算（一）在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo) , 以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（ 二） 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待測(cè)血清樣本得蛋白質(zhì)濃度 （ L）, 并求出人血清 樣本得蛋白質(zhì)濃度.（三）再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出人血清樣本 得蛋白質(zhì)濃度 （ L） 。 器材 中試管 7 支,l 毫升刻度吸管 3 支,10 毫升刻度吸管支，水浴箱， 21 型分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙。 試劑（ ）6 NaOH:稱取 240氫氧化鈉溶于 1000m水中。（二）雙縮脲試劑 :稱取 CuS04&

3、#183;5HO 3。0克,酒石酸鉀 9.0 克與碘化鉀 . 克,分別溶解后混勻 ,加 6 NaH l00m，最后加水至 1000m,貯于棕色瓶 中，避光，可長(zhǎng)期保存 .如有暗紅色沉淀出現(xiàn) ,即不能使用 .（三）、 %NCl （ 四）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液 （0g1）, 稱取干燥得牛血清蛋白 100、 m， 以少量生理鹽水溶解后倒入 0ml 容量瓶中，淋洗稱量瓶數(shù)次 , 一并倒入容量瓶 中，最后加生理鹽水至刻度線 , 或用凱氏定氮法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量 , 然后稀釋成 0mg/1 作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（五）待測(cè)血清樣本 :將人血清或動(dòng)物血清用生理鹽水稀釋 0 倍后再測(cè)定。方案二 Foli -酚試劑法 （Lo

4、wry 法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目得 掌握 Lo ry 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度得原理 . 原理 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與 C2+螯合, 形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物 , 此復(fù)合 物使酚試劑得磷鉬酸還原 , 產(chǎn)生藍(lán)色化合物 ,在一定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白 質(zhì)濃度得線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)得濃度 . 操作 取試管 7 支、編號(hào)、按下表操作 :生理鹽水生理鹽水立即混勻，在 2025水浴保溫 30分鐘.用6m比色,測(cè)定光密度值 .操作注意事項(xiàng)：1. 按順序添加試劑. 試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下 （試劑甲）易被破壞 , 因此加試劑乙后 要立即混勻，加一管混勻一管，使試劑乙 （ 磷目酸）在破壞前即

5、被還原。計(jì)算一 ） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 以濃度為橫坐標(biāo)， 光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（ 二）以測(cè)定管光密度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度 （g L）。（三） 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中 蛋白質(zhì)濃度（）。 器材 （一）71 型分光光度計(jì)（- ）恒溫水浴箱（三） 中試管支（ 四）刻度吸管 :1 、 0m二支; 、5ml 一支;5 、0m一支。試劑（一） 試劑甲（ ） 碳酸鈉（ Na2CO）溶液（2）0 、 2N氫氧化鈉溶液（ ）1%硫酸銅溶液 （C O4·5H2O）（4 ）2%酒石酸鉀鈉溶液 （ 或酒石酸鉀或鈉）在使用前 （1） 與（）、 （

6、3 ）與（ 4） 等體積混合，再將兩混合液按 50：1 比例混合 , 即為試劑甲。該試劑只能用一天，過(guò)期失效。（一） 試劑乙：（1） 市售酚試劑在使用前用 NaH滴定,以酚肽為指標(biāo)劑 , 根據(jù)試劑酸度 將其稀釋 , 使最后酸度為 1N。（2）或取aWO4H2O 00g與 Na2M 25.溶于蒸餾水 700m中， 再加5% H3P4 50m與HCl（濃） 1m,將上物混合后 ,置 0ml圓底 燒瓶中溫與地回流十小時(shí) ,再加硫酸鋰（ Li 2SH2O）15,水 50l 及溴水?dāng)?shù) 滴。繼續(xù)沸騰 5分鐘后以除去剩余得溴 , 冷卻后稀釋至 1000m然后過(guò)濾，溶液 應(yīng)呈黃色或金黃色 （如帶綠色者不能用）

7、 , 置于棕色瓶中保存 , 使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn) NaOH 滴定，以酚酞為指示劑，而后稀釋約一倍，使最后酸度為 1。（三）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用結(jié)晶牛血清白蛋白，根據(jù)其純度用蒸餾水配制成 0、2 / l 得蛋 白質(zhì)溶液。（純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定 ）.（四）待測(cè)樣品 : 準(zhǔn)確取血清 0、1ml，置于 0l 容量瓶中，再加 0、9 Cl 溶液至刻度 ,充分混勻，也可以用尿液為樣品。方案三 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目得 ：掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量得原理 , 熟悉紫外分光光度計(jì)得使 用。 原理蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵得酪氨酸、 色氨酸等芳香族氨基酸。 它們具有吸 收紫外光得性質(zhì) , 其

8、吸收高峰在 280n波長(zhǎng)處， 且在此波長(zhǎng)內(nèi)吸收峰得光密度值 與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定得依據(jù) , 但由于各種蛋白質(zhì)得酪 氨酸與色氨酸得含量不同，故要準(zhǔn)確定量 , 必需要有待測(cè)蛋白質(zhì)得純品作為標(biāo)準(zhǔn) 來(lái)比較，或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考。 另外，不少雜質(zhì)在 280nm波長(zhǎng)下也 有定吸收能力 , 可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸 （嘌呤與嘧啶堿 ） 得影響更為嚴(yán)重。 然而核酸得最大吸收峰就是在 6 nm.因此溶液中同時(shí)存在核酸時(shí)， 必須同時(shí)測(cè) 定 Onm，與 O280n。，然后根據(jù)兩種波長(zhǎng)得吸收度得比值 , 通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式校 正, 以消除核酸得影響而推算出蛋白質(zhì)得真實(shí)含量。本法操作簡(jiǎn)便迅速

9、，且不消耗樣品（可以回收 ）, 多用于純化之蛋白質(zhì)得微 量測(cè)定。主要缺點(diǎn) : 當(dāng)待測(cè)得蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中得酪氨酸與色氨酸含量差異 較大時(shí),則產(chǎn)生-定誤差, 混有核酸時(shí)必須分別測(cè)定 280nm與 260兩處得 OD值, 再按公式推算蛋白質(zhì)含量。 操作 取試管支 ,按下表操作 : 0、4 3、6各管混勻 , 盛于石英杯中，用紫外分光光度計(jì) , 以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn) , 分別于 280nm、260n波長(zhǎng)下測(cè)定各管光密度 , 計(jì)算 （一） 直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液與待測(cè)液得光密度值 （OD28nm）, 或從標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 求得樣本蛋 白質(zhì)含量。以標(biāo)準(zhǔn)管各管光密度值為縱坐標(biāo) , 以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,

10、然后根 據(jù)測(cè)定管光密度值 , 直接查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本中蛋白質(zhì)得含量。1. 選一種與待測(cè)樣本蛋白質(zhì)氨基酸組成相近似得蛋白質(zhì)純品 , 用生理鹽水稀釋 至濃度為 m /m1，作為稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。2用生理鹽水稀釋待測(cè)樣本蛋白質(zhì)至濃度約為 lmg/m，即為稀釋樣本蛋白質(zhì) 溶液。（ 二 ） 利用經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算樣本蛋白質(zhì)含量 ,準(zhǔn)確吸取血清樣本 0、1ml, 置于 50m容量瓶中 , 用生理鹽水稀釋至刻度 , 即 00倍稀釋,在 280nm與 26nm兩處波長(zhǎng)分別測(cè)得光密度值、再按下列公式 計(jì)算.、O8/D20<1、5時(shí),用owryKao公式 :樣本蛋白質(zhì)含量 （/m1）1、4D280一 0、7

11、OD2602、OD280/OD260、 5時(shí)，用 Lm r Bee定律計(jì)算 :樣本蛋白質(zhì)含量（ mgm） = OD280K×L（OD06、3×）× 10gL 本實(shí)驗(yàn)樣品 : 牛血清白蛋白 E%cm=6、 3（100ml/cm 、 g）K：克分子消光系數(shù) ; 1%cm:百分比吸光度得吸光系數(shù)； 注：不同蛋白質(zhì)中得酪氨酸與色氨酸含量有差異 , 故標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管得蛋白質(zhì)氨 基酸組成應(yīng)相似 , 以減小誤差。 器材（ 一） V 200紫外分光光度計(jì)（二）50 容量瓶 試劑（ 一 ） 生理鹽水（ 二 ） 清蛋白（人或牛 ） 純晶（ 三 ） 待測(cè)樣本蛋白質(zhì) : 用雙縮脲法測(cè)定蛋

12、白質(zhì)得樣品用生理鹽水稀釋而成。方案四 考馬斯 （e sie） 亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮蘭結(jié)合法就是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)得蛋白質(zhì)定量測(cè)定法 . 本方法具有操 作方便、快速、干擾因素少得特點(diǎn) .【原理】考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)得疏水微區(qū)相結(jié)合 , 這種結(jié)合具有高敏感性，考 馬斯亮蘭 G25 得最大光吸收峰在 4 nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí) 其最大吸收峰改變?yōu)?595 m?？捡R斯亮蘭 G5蛋白質(zhì)定量測(cè)定得高敏性度。在一定范圍內(nèi) , 考馬斯亮蘭 G50-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色。在 95m下,光 密度與蛋白質(zhì) 含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量得測(cè)定?！静僮鳌?（常量法）（ 一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：配制

13、g/ml 得標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。制備系列稀釋液 ,其濃度分別為 1000 /ml ，50 /ml, 250g/m,125ml ，、 5gml 與 31、 gml.按下表操作：搖勻，室溫靜置 3 分鐘. 在第一管為對(duì)照管，在 721 型分光光度計(jì)于波長(zhǎng) 5m處比色讀取光密度。以各管光密度為縱座標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度 （ g ）作為橫座標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。（ 二）未知樣品測(cè)定 :取血清、 25ml直接置于 50l 容量瓶中 , 加生理鹽水至刻度 ,搖勻。（此 法樣品稀釋 20倍）。取試管二只，按下表操作 :搖勻,靜置 3分鐘，在 721型分光光度計(jì)亡波長(zhǎng) 595n比色,讀取光密度,查標(biāo)準(zhǔn) 曲線，求得稀釋樣品蛋

14、白質(zhì)濃度?！居?jì)算】未知樣品蛋白質(zhì)濃度 g/m=稀釋樣品濃度×稀釋倍數(shù)【優(yōu)缺點(diǎn)】（ ）操作簡(jiǎn)便、快速 ; 檢測(cè)靈敏；重復(fù)性好。（二）顯色迅速.約于 2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)得結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在l 小時(shí)內(nèi)就是穩(wěn)定得。三）與改良 Lowy 氏法相比，干擾物質(zhì)較少（ 四） 當(dāng)樣品中存在較大量得十二烷磺酸鈉 （SD） 、Tri n 10等去 垢劑時(shí), 顯色反應(yīng)會(huì)受到干擾。如樣品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色，故必須 預(yù)先處理樣品。（ 五）考馬斯亮蘭 G0染液不宜久存 ,以-2月為宜。（六）微量法測(cè)定蛋白含量范圍為 10; 常量法測(cè)以檢測(cè)范圍 0-100 g 為宜。【器材】（ 一 ） 試管 l

15、支（ 二）吸管 10ml、 5l 、lml 、 O、 1ml 各支。（ 三） 721分光光度法 , 普通比色杯 4只。【試劑】（一） O、9%NaCl（二）待測(cè)血清（ 三）標(biāo)準(zhǔn)血清（ 四） 染液：考馬斯亮蘭 25 0.1 克溶于 0. 1 5%乙醇。再加入 0m1 85（ /V）磷酸。然后加蒸餾水定容到 1000ml. 此時(shí)溶液為 0.0l 考馬斯亮蘭 G20/、7（WV）/ 乙醇/8 、5%（ V）磷酸。方案五 B A法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度【目得】 : 掌握 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度得原理?！驹怼?:BCA（bic ncho ini c acid） 與二價(jià)銅離子得硫酸銅等其她試劑組成得 試劑,混合

16、一起即成為蘋果綠 ,即 BA工作試劑。在堿性條件下， CA與蛋白質(zhì) 結(jié)合時(shí) , 蛋白質(zhì)將 C 2還原為 C, 一個(gè) u螯合二個(gè) C分子 , 工作試劑由原 來(lái)得蘋果綠形成紫色復(fù)合物 , 最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比?！静僮鳌?標(biāo)準(zhǔn)曲線得繪制 : 取試管七支、編號(hào)計(jì)算】（ 一 ） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（ 二） 以測(cè)定管吸光度值 , 查找標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度（ g/ ） 。（ 三 ） 再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者 , 求出待測(cè)血清中蛋白 質(zhì)濃度 （g/ ）?！緝?yōu)缺點(diǎn)】（一） 操作簡(jiǎn)單，快速， 45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典得 Low y法快 4倍且更 加方便;（二） 準(zhǔn)確靈敏,試劑穩(wěn)定性好 , CA試劑得蛋白質(zhì)測(cè)定范圍就是 2000 g/ml ，微量 BA測(cè)定范圍在 0、5-1 g ml。（ 三 ） 經(jīng)濟(jì)實(shí)用 , 除試管外 , 測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行， 大大節(jié)約樣品與試劑用量 ;（ 四 ） 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑 , 尿素等均無(wú)影響。【器材】（ 一） 720 型分光光度計(jì)（ 二 ） 恒溫水浴箱（三）中試管支（ 四） 槍式移液管【試劑】1、 試劑 A：1 BCA二鈉鹽%無(wú)水碳酸鈉、16酒石酸鈉0、%氫氧化鈉0