海藻糖二十碳五烯酸酯的合成與表面性能(翻譯)

1、海藻糖二十碳五烯酸酯的合成與表面性能摘要：海藻糖二十碳五烯酸酯是以二十碳五烯酸乙酯和海藻糖為底物，利用微生物脂肪酶在叔丁醇中通過脂基轉(zhuǎn)換合成的。反相高效液相色譜法加上二極管陣列檢測和電噴霧質(zhì)譜（RPHPLC-DAD-ESI-MS）分析表明，該反應(yīng)混合物中存在單酯和二酯。采用硅膠柱色譜法預(yù)處理反應(yīng)混合物，然后再用高效液相色譜法洗脫海藻糖二十碳五烯酸酯，進一步純化。通過ESI-MS和核磁共振（NMR）對該化合物的結(jié)構(gòu)進行表征。證實，單酯為 6-O-海藻糖二十碳五烯酸單酯。接著，我們將海藻糖二十碳五烯酸酯的表面性能進行了研究。結(jié)果顯示表面張力，cmc 和Gomic隨著溫度的升高降低，但是每個分子占據(jù)

2、的面積略有增加。關(guān)鍵詞：海藻糖二十碳五烯酸酯、酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、表面特性介紹膳食長鏈脂肪酸的二十碳五烯酸（EPA，20：5n- 3）屬于n-3不飽和脂肪酸（多不飽和脂肪酸），其具有多種生物活性，并有生理功能1,2。一些研究表明，它可用于預(yù)防和治療心血管疾病3-5。Stulnig6和Li7報道表明EPA可以從膜筏置換?；鞍踪|(zhì)，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。EPA也可以在各種炎癥的治療臨床應(yīng)用作為輔助免疫抑制劑。西田8提供的研究表明，EPA可能對H2O2氧化損傷起到內(nèi)源性保護作用。Mori 9也顯示EPA可降低體內(nèi)氧化應(yīng)激。哈德曼10發(fā)現(xiàn)，EPA可以增加抗癌藥物的有效性。巴布科克11報道，

3、EPA補充劑可以促進保持體重和抑制腫瘤發(fā)展。此外，一些文章也顯示出n- 3脂肪酸可以對人類癌癥治療有幫助12-14。EPA也作為預(yù)防醫(yī)學(xué)治療的推薦措施。乙基二十碳五烯酸的酯已經(jīng)被用于在動脈硬化性閉塞癥，高血脂的治療15。然而，EPA是不穩(wěn)定的，很容易在暴露于氧或活性氧中被氧化成脂質(zhì)自由基或脂質(zhì)過氧自由基。雖然，在PUFA的主體相氧化已經(jīng)研究充分，也有一些研究表明該多不飽和脂肪酸的在主體相的氧化穩(wěn)定性從水性體系中16,17顯著不同，Endo等人的報道稱甘油三酯的氧化含有二十碳五烯酸和二十二碳六酸取決于氧化系統(tǒng)和甘油三酯結(jié)構(gòu)。Chaiyasit等人認(rèn)為界面膜屬性的改變與表面活性劑的屬性有關(guān)，同時表

4、面活性劑性能影響油包水乳液液滴的氧化。為了更好地理解多不飽和脂肪酸在具有最小影響因素的水溶液中的氧化，我們使用膠束作為模型系統(tǒng)。我們所用的兩性的EPA酯是具有表面活性的，并且可以在水溶液中作為一個起作用表面活性劑。海藻糖是在自然界中很穩(wěn)定寡糖，是一個非還原性糖，海藻糖具有熱穩(wěn)定性及不發(fā)生美拉德反應(yīng)。根據(jù)Kohya20和Okabe 21報道，海藻糖有抗腫瘤作用。因此，我們使用海藻糖作為羥基提供者。 Cerda'n等22報告了從多不飽和脂肪酸濃縮甘油魚肝油經(jīng)酯化生產(chǎn)高度EPA-和富含DHA的甘油三酯。Shimada等人23認(rèn)為可通過酶法催化二十二碳六，二十碳五，花生四烯酸，和c-亞麻酸的合

5、成固醇酯。Yamamura 24報道的方法以純化十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸乙酯。然而，很少有數(shù)據(jù)提供兩性海藻糖的分離和純化酯EPA的。在這里，我們采用高效液相色譜法結(jié)合硅膠柱色譜法純化海藻糖二十碳五烯酸酯。此外，我們探討了海藻糖二十碳五烯酸酯在水溶液的表面性質(zhì)。材料和方法材料：Novo435（南極假絲酵母脂肪酶B固定在一大孔聚丙烯樹脂）購自購的Novozyme（Bagsvaerd，丹麥）。海藻糖二水合物（純度>98）是從ST公司（上海，中國）購得。EPA乙酯（純度>70）由無錫市迅達海洋生物制品檢定所購得（中國，無錫）。高效液相色譜法級甲醇是從江蘇Hanbon科技有限公司獲得

6、（淮安，中國）。分析純其它試劑均為從中國醫(yī)藥集團（上海，中國）購得。海藻糖二十碳五烯酸酯在間歇式反應(yīng)器合成。海藻糖（0.75克，在干燥器中預(yù)干燥）和EPA乙酯酯（1.96克）混合，用150毫升叔丁醇。該縮合反應(yīng)，從加入脂肪酶（0.75克）開始。該棕色反應(yīng)容器充滿惰性氮塞住后固定在定軌搖床上，其裝有一個連續(xù)振蕩溫控器（上海景洪實驗室儀器有限公司有限公司，中國上海）設(shè)定在50和以150rpm轉(zhuǎn)速工作48h。溶劑在使用前用脫水分子篩（4埃）過濾至少24h。海藻糖二十碳五烯酸酯純化：使用RPHPLCDAD-ESI-MS的反應(yīng)混合物進行分析，然后在硅膠柱進行預(yù)分離純化，再使用HPLC。分析該反應(yīng)混合物的

7、RPHPLC-DAD-ESI-MS，由Waters ZMD平臺4000系統(tǒng)組成。該系統(tǒng)包括了Micromass ZMD質(zhì)譜儀和配備有沃特斯996二極管陣列檢測器（沃特斯公司，米爾福德，MA，USA）的Waters2690 HPLC構(gòu)成。數(shù)據(jù)用是用MassLynx處理軟件4.0版本（Micromass，沃特斯的子公司，富康，MA，USA）。反相ODS-A色譜柱（250mmX94.6mm，內(nèi)徑和粒徑5m，YMC，日本）用于在柱溫設(shè)定在35進行分離。將預(yù)處理的反應(yīng)混合物取樣10L注入到HPLC中。用0.3甲酸（溶劑A），甲醇（溶劑B）和己烷（溶劑C）以1ml/min恒定流速梯度洗脫。其線性梯度分布型

8、如下：15A，85B，0C啟動，然后在15min時0A，100B和0C，然后在20min時0A，90B和10C，在25min是15A，85B和0C落回。該峰用二極管陣列檢測器檢測。海藻糖二十碳五烯酸酯的混合物在205nm處進行分析。大規(guī)模的頻譜是通過電噴霧電離的正面和負(fù)面的模式獲得。離子電壓使用如下：毛細(xì)管4.23kV（負(fù)）和4.20kV（正），錐36 v（負(fù)）和36 V（正），提取5 V和光電倍增器650 V.源塊溫度為100和去溶劑化溫度為250。該分析儀真空度是2.6e-5mBar。連續(xù)大規(guī)模光譜是由200到1400 M / Z連續(xù)掃描獲得。硅膠柱色譜條件如下：流動相梯度正己烷-異丙醇-

9、甲醇5：4：1（v/v/v）和4：4：2（v / v/ v）依次被使用。流速為1.3ml/min，洗脫液的收集與分析采用薄層色譜法。海藻糖二十碳五烯酸酯薄層色譜分析在硅膠上進行預(yù)涂板（25mm×75mm，青島海洋化工有限公司，青島，中國）。薄層流動相為乙基乙酸乙酯/甲醇/水（8.5/ 1 /0.5，v/v/v）并用碘液顯影。這兩個海藻糖單酯和雙酯都出現(xiàn)褐色斑點。因此是海藻糖二十碳五烯酸酯混合物。半制備性HPLC進行純化，使用的是Waters的Sunfire-C18色譜柱（150mm×19mm，內(nèi)徑，10m）。純化使用甲醇和水（85:15的混合物，v/v）在35進行洗脫。流速

10、為8ml/min和樣品的注入體積為1ml。將產(chǎn)物在205nm處檢測，然后收集用液相色譜法進一步分析鑒定并通過質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）鑒定。海藻糖二十碳五烯酸酯鑒定：海藻糖二十碳五烯酸酯的純度通過半制備性HPLC，其使用島津制作所的LC-20A裝置與使用Waters的Sunfire-C18色譜柱（150mmX94.6mm，內(nèi)徑，5m）測定，甲醇和水（85:15，v/v）在35作為混合物中洗脫劑。樣品的施加量為10L，洗脫液的流速為1mL/min。利用PDA檢測器進行含量分析。純凈的化合物結(jié)構(gòu)研究是根據(jù)使用上述Bruker方法和NMR鑒定進行的，使用MS分析AM-500光譜儀（Bruker

11、公司分析儀器，Rheinstetten的，德國），在500MHZ測定1 H和13 CNMR。氘甲醇（CD3OD）作為溶劑，四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)物。親水親油平衡值（HLB）的計算:根據(jù)格里芬25，HLB值是尺寸和親水性和親脂性部分表面活性劑分子的強度的平衡。可通過下式計算HLB值：HLB = 20 X（親水基團的分子量/總的表面活性劑的分子量）克羅夫特26表示，如果乳化劑是更可溶于水相中的，然后就可以形成油包水乳液。正如預(yù)期的那樣，根據(jù)HLB值的界定，具有高的HLB值的材料形成O / W乳化劑，而具有低HLB值的材料會形成W / O型乳化劑。HLB值在3-6范圍內(nèi)被認(rèn)為是W / O乳化；

12、值在8-18內(nèi)被認(rèn)為是O / W乳化27。表面張力測量：海藻糖二十碳五烯酸酯溶于二次蒸餾水。水溶液的靜態(tài)表面張力使用KRUSS的K-12張力計測得的基于該DU Nouijy（KRUSS GmbH的，漢堡，德國）環(huán)方法，基于一濃度分別在30，40，50，和60的函數(shù)。該測量在稀溶液中開始，然后掛幾何形狀確切已知的水平白金環(huán)（R =0.955厘米），使用二次蒸餾水校正表面張力。每次測量之前通過燃燒（煤氣燈）去除鉑金環(huán)殘留的沉積物。環(huán)浸入液體進行測量然后再拉出再次測量。該最大表面張力需要通過拉環(huán)表示在MN M-1上。每條曲線所示是三個重復(fù)實驗的平均結(jié)果。CMC與CMC評價：臨界膠束濃度（CMC）是一

13、種特征值用于在限定的溫度和特定的溶劑中的測定給定的表面活性劑。海藻糖二十碳五烯酸酯的CMC值水溶液從打破表面張力Ç計算得到濃度曲線對數(shù)。CMC是對應(yīng)于CMC中的表面張力。結(jié)果與討論海藻糖二十碳五烯酸酯的純化:RPHPLC-DAD分析表明，該反應(yīng)混合物是含有單酯，二酯和其它雜質(zhì)的復(fù)雜系統(tǒng)（圖1）。主要離子通過HPLC-DAD-ESI-MS檢測：海藻糖二十碳五烯酸酯（要求，M1 626.33，M1+Na + 649.55，M1+ K+ 665.44，2M1+Na+ 1276.12；M1-H- 625.65，M1 + HCOO- - 671.62，2M1-H- 1252.16；海藻糖單酯（

14、需M2 910.54，M2+Na+ 933.96，M2+ K+ 949.98，M2- 910.07，M2+ HCOO- - 956.02）（圖2）。含有單酯和二酯的反應(yīng)混合物中進行過濾，除去固定脂肪酶。該剩余混合物在減壓下濃縮，然后利用硅膠柱色譜法過濾。玻璃層析柱用錫紙包裹擋住光線，隔離工藝?yán)肨LC監(jiān)測。海藻糖單酯和海藻糖雙酯的Rf值分別為0.354和0.649，這表明該硅膠柱色譜法的條件是合理的，反應(yīng)混合物可能是足夠分開。要獲得具有較高純度的產(chǎn)品，從硅膠柱上海藻糖二十碳五烯酸酯開始進一步通過半制備HPLC純化。HPLC收集對應(yīng)峰的保留時間為13.2-15.5min，并進行分析。單峰表示化合

15、物沒有雜質(zhì)，并沒有包含異構(gòu)體化合物。這是因為固定脂酶在溶劑中具有優(yōu)異朝向伯羥基6-OH（對應(yīng)于非還原葡萄糖部分）的特定選擇性28,29。此外，海藻糖是一種對稱的分子，并擁有兩個相同主要位置的羥基C6和C6。所述海藻糖二十碳五烯酸酯標(biāo)識通過NMR和MS進一步證實.海藻糖二十碳五烯酸酯的結(jié)構(gòu)解析：純化海藻糖二十碳五烯酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)在重甲醇中通過1H NMR（500 MHz），13C NMR（500 MHz）確定。MHz) and13C NMR (500 MHz) in deuterated methanol. 1H NMR(500 MHz, CD3OD) (ppm): 5.35 (10H, m),

16、 5.09 (1H, d,J = 3.7 Hz), 5.07 (1H, d, J = 3.7 Hz), 4.32 (1H, d,J = 11.5 Hz), 4.18 (1H, dd, J = 11.2, 5.0 Hz), 4.00 (1H, m),3.80 (4H, m), 3.62 (1H, dd, J = 11.8, 5.2 Hz), 3.41 (2H, m),3.33 (2H, m), 2.83 (8H, m), 2.35 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.10(4H, m), 1.65 (2H, m), 0.96 (3H, t, J = 7.5 Hz); 13C NMR(5

17、00 MHz, CD3OD) (ppm): 95.542 (C1), 73.476 (C2),72.200 (C3), 71.699 (C4), 74.787 (C5), 64.824 (C6), 95.406(C1), 73.512 (C2), 72.228 (C3), 71.699 (C4), 74.954 (C5),62.943 (C6)。相應(yīng)于二十碳五烯酸殘基中的碳原子具有下列值：175.504(C = O), 133.108, 130.305, 130.221, 129.764, 129.538,129.494, 129.430, 129.404, 129.236, 128.494

18、(都是CH = CH C)；34.697, 26.231, 26.735, 26.857,27.834, 27.834, 26.857, 21.785 (都是 CH2C)，和14.941 (CH3). MS和NMR分析鑒定化合物，為6-O-海藻糖二十碳五烯酸酯。MS:m/z 649.55 M+Na+, 665.44 M+K+; 625.65 M-H-,1252.16 2M-H- 海藻糖二十碳五烯酸酯的表面性能：海藻糖二十碳五烯酸酯的HLB計算值為10.89；因此，可以作為水包油對于其表面性能的研究。海藻糖二十碳五烯酸酯的測量表面張力示于圖 3。CMC結(jié)果在不同溫度下兩性化合物突然改變，在采取表

19、面張力與濃度曲線結(jié)果表明，海藻糖二十碳五烯酸酯顯著減少在水的表面張力。CMC值表明，表面張力的值迅速下降，而濃度的增加卻改變非常緩慢。這是因為，如兩性分子，海藻糖二十碳五烯酸酯由協(xié)同形成的膠束內(nèi)核疏水烷基鏈的關(guān)聯(lián)，從核心延伸到親水頭基水性介質(zhì)中。只有在高于CMC濃度膠束數(shù)量增加。膠束獲得無變化，因為疏水組位于膠束的內(nèi)部，并且表面張力并沒有進一步減少。結(jié)果還表明，海藻糖二十碳五烯酸酯的表面張力的值隨溫度升高而降低。當(dāng)溫度增加時，多個分子將溶液移入表面相，在溶液上氣態(tài)分子密度增加，這削弱了分子間的吸引力，并減少界面相和體相之間的分子數(shù)之差，然后表面張力下降。海藻糖二十碳五烯酸酯的CMC值被發(fā)現(xiàn)隨著

20、溫度的增加（圖4）逐漸減小。這是因為，在給定溫度下，兩性化合物的CMC值通過范德華力的平衡被約束，互動疏水烷基和水合之間膠束首基是傾向于向上突破的。脫水效果隨著溫度的升高增加分子的疏水性，因此膠束變得有利。于羅森27諸井30也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，他們認(rèn)為CMC的結(jié)論說明兩離子和非離子表面活性劑的值分別為一溫度的函數(shù)。海藻糖二十碳五烯酸酯的CMC值被發(fā)現(xiàn)隨著溫度的增加而降低（圖5）。那是因為分子間的距離隨著溫度升高，這就造成了一個分子和吸附分子之間吸引力減少，隨之而來的包裝較差的每個分子（A）在占據(jù)地區(qū)隨著溫度的升高增加。每區(qū)的估計分子中，A在單分子膜的區(qū)域，利用吉布斯計算出的表面過剩衍生吸附式。其

21、中U是表面過剩，R是通用氣體常數(shù)（8.3 J mol-1 K-1），T是溫度（K），是表面張力（mM m-1）和C是表面活性劑濃度（mol L-1）。每個分子的區(qū)域，A，可以因此很容易被計算出：其中NA是阿伏伽德羅常數(shù)（6.023X1023 mol-1）。作為在CMC是已知的吉布斯自由能吸附或膠束的標(biāo)準(zhǔn)自由能，一個單酰基海藻糖分子（GOmico）在液體表面進行了計算：CMC表達摩爾單位和molsolvent是每升水摩爾的絕對數(shù)量溫度T， Gomico溫度作圖于圖5。隨著溫度的增加，該Gomico走向呈一個負(fù)值指示趨勢，從而更容易地形成膠束。結(jié)論使用非水的酯交換技術(shù)合成兩種海藻糖二十碳五烯酸酯。

22、然后，它使用硅膠柱色譜法和半制備型HPLC純化。將純化的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振為6-O-海藻糖二十碳五烯酸酯。接著，對產(chǎn)品的水溶液進行表面特性研究。所獲得的結(jié)果表明，表面張力，CMC，CMC和Gomico隨溫度增加降低。然而，該每個分子占據(jù)面積卻增加的很少。未來研究將包括EPA水溶液的調(diào)查，所獲得的信息將被應(yīng)用到解釋的EPA的氧化和其在水中的酯解參考文獻1. Bougnoux P, Maillard V, Ferrari P, Jourdan ML, Chajes V (2002)IARC Sci Publ 156:3373412. Castro IA, Monteiro VCB, Barros

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