教學課件-濁度法

1、微生物生長量的測定微生物生長量的測定-濁度法濁度法什么是濁度法什么是濁度法 ？ 可用來測量菌濃度.其原理是發(fā)酵罐中的發(fā)酵液按照一定的流速進入流通式比色皿中,用500-600nm的波長檢測發(fā)酵液的光密度 。 一、濁度法一、濁度法 v 微生物細胞數(shù)量的增加稱為微生物群體生長 。由于微生物個體微小的特殊性，難以針對單個微生物細胞或個體的生長繁殖的研究進行，故除特定的研究目的外，一般所言的微生物生長是指群體生長。 微生物群體生長規(guī)律微生物群體生長規(guī)律 v以培養(yǎng)時間為橫坐標，以計數(shù)獲得的細胞數(shù)的對數(shù)為縱坐標，可得到一條定量描述液體培養(yǎng)基中微生物生長規(guī)律的實驗曲線，該曲線則稱為細菌的生長曲線（ growt

2、h curve ，見圖 ）。微生物群體生長規(guī)律微生物群體生長規(guī)律 v細菌生長曲線可劃分為四個時期，即： 延遲期， 對數(shù)生長期， 穩(wěn)定期； 衰亡期。生長曲線表現(xiàn)了細菌細胞及其群體在新的適宜的理化環(huán)境中，生長繁殖直至衰老死亡的動力學變化過程。生長曲線各個時期的特點，反映了所培養(yǎng)的細菌細胞與其所處環(huán)境間進行物質(zhì)與能量交流，以及細胞與環(huán)境間相互作用與制約的動態(tài)變化。 微生物群體生長規(guī)律微生物群體生長規(guī)律 v 微生物在適宜的環(huán)境條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，并按照自己的代謝方式進行代謝活動，如果同化作用大于異化作用，則細胞質(zhì)的量不斷增加，體積得以加大，于是表現(xiàn)為生長。簡單地說，生長就是有機體的細胞組分與結(jié)

3、構(gòu)在量方面的增加。生長與繁殖與細胞生長量測量意義生長與繁殖與細胞生長量測量意義 v根據(jù)微生物的生長曲線可以明確微生物的生長規(guī)律，對生產(chǎn)實踐具有重大的指導意義。故根據(jù)對數(shù)期的生長規(guī)律可以得到培養(yǎng)菌種時縮短工期的方法:接種對數(shù)期的菌種,采用最適菌齡，加大接種量，用與培養(yǎng)菌種相同組成的培養(yǎng)基。有如，根據(jù)穩(wěn)定期的生長規(guī)律，可知穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期，也是最佳測定期，通過對穩(wěn)定期到來原因的研究還促進了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝技術(shù)的創(chuàng)建。生長與繁殖與細胞生長量測量意義生長與繁殖與細胞生長量測量意義 一、直接法v（1）測體積 v 它是一種較為粗放的方法，通常用于初步比較用。例如將待測培養(yǎng)液放在刻度離心管中

4、作自然沉降或進行一定時間的離心，然后觀察沉降物的體積。v（2） 稱干重 v 采用離心法或過濾法測定，一般干重為濕重的10%20%。通過生長量測定通過生長量測定微生物生長微生物生長二、間接法v（1）生理指標法 ：與生長量相平行的生理指標很多，它們均可用作生長測定的相對值v1） 測定細胞總含氮量來確定細菌濃度 大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。總氮量與細胞粗蛋白的含量的關(guān)系可用（粗蛋白總量=含氮量%6.25）含氮量的測定方法有很多，常用凱氏定氮法。通過生長量測定通過生長量測定微生物生長微生物生長v 2）含碳量的：將少量生物材料混入1ml水或無機緩沖液中，用2m

5、l 2%重鉻酸鉀溶液在100下加熱30分鐘，冷卻后，加水稀釋至5ml，在580nm波長下測定光密度值（用試劑作空白對照，并用標準樣品作標準曲線），即可推算出生長量。v 3）其它 磷、DNA、RNA、ATP和 N乙酰胞壁酸等的含量，以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)CO2（用標記葡萄糖作基質(zhì)）、耗氧、粘度和產(chǎn)熱等指標，均可用于生長量的測定。通過生長量測定通過生長量測定微生物生長微生物生長v（2）比濁法 v微生物在液體培養(yǎng)基中生長，由于原生質(zhì)含量的增加，引起培養(yǎng)物混濁度的增高。某一未知濃度的菌液在透射光下用肉眼與某一比濁管進行比較，如果兩者的濁度相當，即可目測出該菌液的大致濃度。v精確的測定，要用分光光度計進行。

6、在可見光的450650nm波長內(nèi)均可測定。通過生長量測定通過生長量測定微生物生長微生物生長一、直接法v直接法即是在顯微鏡下直接觀察細胞并進行計數(shù)的方法，其計數(shù)結(jié)果是包括死細胞在內(nèi)的總菌數(shù)。v（1）比例計數(shù)法 v是一種粗放的計數(shù)方法。將已知顆粒（例如霉菌的孢子或紅細胞等）濃度的液體與待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，然后鏡檢各自的數(shù)目，求出未知菌液中的細胞濃度。通過計數(shù)測定微生物生長通過計數(shù)測定微生物生長v（2）血球計數(shù)板法 v 計數(shù)一定容積中的細胞總數(shù)的常用方法，此法對細胞較大的酵母菌較為適用通過計數(shù)測定微生物生長通過計數(shù)測定微生物生長二、間接法v是一種活菌計數(shù)法，其原理是活菌在液體培養(yǎng)基

7、中生長繁殖使液體混濁，在固體培養(yǎng)基表面形成菌落，然后計數(shù)活菌的方法。v（1）平板菌落計數(shù)法 v標準方法將待測樣品稀釋，然后取適宜的稀釋度樣品與固體培養(yǎng)基混勻，凝固后培養(yǎng)，然后計數(shù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以樣品的稀釋度，即可計算出樣品的含菌數(shù)。 通過計數(shù)測定微生物生長通過計數(shù)測定微生物生長v（2）液體稀釋法 v 對未知樣品作10倍系列稀釋。選適宜的3個連續(xù)的10倍稀釋液各取5ml，接種到3組共15支液體培養(yǎng)基試管中，每管接入1ml，培養(yǎng)一定的時間后，計錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查MPN表，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)可計算出其中的活菌含量。通過計數(shù)測定微生物生長通過計數(shù)測定微生物生長方 法應(yīng) 用 直接

8、法涂片染色法血球計數(shù)板法比濁法 可同時計數(shù)不同類型的 微生物數(shù)量，常用于牛奶、土壤中的細菌計數(shù)可用于不同類型微生物的計數(shù)微生物學分析，肉湯培養(yǎng)物或水懸浮液中的細菌數(shù)估計 間接法平皿菌落計數(shù)法液體稀釋法薄膜過濾計數(shù)法 食品、水、土 壤、醫(yī)學、衛(wèi)生以及培養(yǎng)物中的細菌計數(shù)因某種原因而不能用瓊脂平皿活菌計數(shù)時被采用，如牛奶等適用于量大而且含菌數(shù)很低的材料，如空氣、水等 測定細胞物質(zhì)量定氮法測 DNA法測定細胞干重法生理指標測定法 主要用于代謝研究，適于細胞濃度高的樣品同上用于調(diào)查研究，適用于細胞濃度高的材料微生物學分析研究v一、準備菌種： 將細菌接種到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)18h，另外準備單菌落平板1塊濁度濁度法測定菌體量法測定菌體量v二、分組分為三個小組： 取1.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基, 37 200rpm 取3.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm 取5.0ml大腸桿菌菌液接種到100ml培養(yǎng)基，37 200rpm 每培養(yǎng)一小時取樣一次(2.5h,3.5h加測1次). 對照組測量起始pH,所有瓶子測量發(fā)酵9h結(jié)束測pH