《基因工程原理》教學(xué)案

1、基因工程原理教案二O一二年修訂稿XX大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院第一章緒論重點(diǎn)：基因工程的概念和內(nèi)容,基因工程技術(shù)在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位和作用。難點(diǎn)：基因工程與遺傳工程的區(qū)別。一前言生物工程主要有基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等4個(gè)部分。二什么是基因、基因工程應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子、重組體,繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞,再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝或其表達(dá)產(chǎn)物。三基因工程的主要內(nèi)容目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定四基因工程的歷史及我

2、國(guó)開展基因工程的現(xiàn)狀第二章基因工程的基本操作技術(shù)重點(diǎn)：PCR技術(shù)和基因定點(diǎn)誘變技術(shù)。包括PCR支術(shù)的原理，反向PCR與染色體步移，不對(duì)稱PC叫DNA序列測(cè)定,PC叫RAPD,RT-PCRRNA分析；基因定點(diǎn)誘變的原理，盒式誘變，寡核甘酸引物誘變和PCR誘變。難點(diǎn)：酶學(xué)測(cè)序的原理和程序，基因化學(xué)合成的原理和程序。一凝膠電泳技術(shù)在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)Polyanionso將DNARNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極一正極移動(dòng)。?瓊脂糖凝膠電泳?聚丙烯酰胺凝膠電泳?脈沖場(chǎng)凝膠電泳?RNA電泳二細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)?轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞感受態(tài)細(xì)菌

3、從周圍介質(zhì)中吸收來自另一種基因型細(xì)胞的DNA,進(jìn)而使原來細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。?提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。常見轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法三核酸雜交技術(shù)?所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核甘酸序列的單鏈DNA或RNA當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。?Southernblot;Northernblotting;斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交；菌落原位雜交注意比較四DNA序列分析技術(shù)四DNA測(cè)序分析?DNA鏈末端合成終止法：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板,合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；該酶

4、能夠用2',3'-雙脫氧核甘三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核甘酸鏈的3'-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA,引物特異性引物，如T7,T3,M13等,DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無5'-劭卜切酶活性。?Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法<哈佛大學(xué)>:該方法的基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈降解產(chǎn)物,經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后,可直接讀出待測(cè)DNA片段的核甘酸序列。?DNA雜交測(cè)序法<SBH

5、-Sequencingbyhybridization>如果一段較短的DNA探針能與較長(zhǎng)的DNA片段雜交,并形成完全的雙鏈結(jié)構(gòu),我們就推測(cè)在靶DNA上存在著相應(yīng)的互補(bǔ)序列，這就是DNA雜交測(cè)序法的基本原理。用一組已知系列的寡核苷酸短序列做為探針,同某一較長(zhǎng)的靶DNA分子雜交,從而測(cè)定其序列。五基因的化學(xué)合成六PC叱術(shù)?PCRS應(yīng)體系的設(shè)立?PCRK應(yīng)程序設(shè)計(jì)?引物設(shè)計(jì)原理?PC叱術(shù)應(yīng)用七基因定點(diǎn)誘變技術(shù)使已克隆基因或DNA片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程叫作基因的定點(diǎn)誘變,是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。?盒式誘變cassettemutagenesis包括盒式取代誘

6、變和混合寡核甘酸誘變兩種方式。?寡核苷酸引物誘變應(yīng)用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段做引物,進(jìn)行DNA復(fù)制，使寡核甘酸引物成為新合成的DNA子鏈的一個(gè)部分?PCRB變：重組PCRt點(diǎn)誘變、大引物誘變八DNA與蛋白質(zhì)相互作用?凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)Gelretardationassay又稱DNA遷移率變化試驗(yàn)DNAmobilityshiftassay,DMSADNA與蛋白質(zhì)結(jié)合后分子量變大，改變了遷移率，由此判斷DNA是否與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合?DNaseI印跡試驗(yàn)DNaseIfootprinting用于檢測(cè)與蛋白結(jié)合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域

7、。?甲基化干擾實(shí)驗(yàn)：根據(jù)DMS硫酸二甲酯能夠使G殘基甲基化，而六氫口比咤又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理。這種技術(shù)可以檢測(cè)靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)于此后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng),從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性時(shí)，它只能使G殘基甲基化，但仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。第三章基因工程的工具酶重點(diǎn)：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶的生化特征、作用原理和應(yīng)用領(lǐng)域。包括n型限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，大腸桿菌DNA連接酶，大腸桿菌DNA聚合酶I,Klenow酶,T

8、4DNA聚合酶,T7DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，TaqDNA聚合酶，PfuDNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶。T4多核苷酸激酶、堿性磷酸酶和末端轉(zhuǎn)移酶的作用原理和應(yīng)用領(lǐng)域。難點(diǎn)：切口轉(zhuǎn)移與核苷酸標(biāo)記技術(shù)一限制性內(nèi)切酶和甲基化酶在DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位,切割DNA分子,產(chǎn)生鏈的斷裂。兩個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。二DNA連接酶能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3'-羥基OH和5-磷酸基團(tuán)-P在NAD+或ATP供能的作用下,形成磷酸二酯鍵。只能連接切口nick,不能連接缺口gap。而且被連接的DNA鏈必需是雙螺旋D

9、NA分子的一部分。三DNA聚合酶1 、E.coliPolI的特點(diǎn)1具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個(gè)大小不同的片段，其中小片段具5'-3'外切酶活性，大片段具3'-5'外切酶活性和聚合酶活性大片段亦稱為Klenow片段。2聚合酶活性5'-3；要求3'-OH引物和模板DNA,其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響2 、Klenow片段由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后,產(chǎn)生出來的大片段分子。仍具有5'f的聚合酶活性和3'f用）外切酶活性，失去了全酶的5'f外切酶活性。3、T4DNA聚合酶從T4

10、噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶，具有5'-3'的聚合酶活性和3'-5'外切酶活性。5'f3'聚合酶活性，1500nt/min,為PolI的兩倍3'-5'外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min4、反轉(zhuǎn)錄酶許多RNA腫瘤病毒中分離到這種酶,最常用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶AMVAMV具有“鏈和3鏈；“鏈具有聚合酶活性和RNaseH活性；3鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的5'-3核酸外切酶活性5、T7DNA聚合酶1978年,S.Tab

11、or從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來的一種聚合酶。加工形式的T7DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋白質(zhì)，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白。基因5蛋白質(zhì)：具有聚合酶活性和3'-外切酶活性；硫氧還蛋白：增強(qiáng)基因5蛋白質(zhì)與模板引物的結(jié)合力具有5'f的聚合酶活性和很高白單鏈及雙鏈的3'T弟酸外切酶活性。四DNA和RNA修飾酶1、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶terminaldeoxynucleotidyltransferase,從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質(zhì),在二甲胂酸緩沖液中,能催化脫氧核苷三磷酸進(jìn)行5'f方向

12、的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核甘酸分子加到線性DNA分子的3'-OH末端。2、T4多核甘酸激酶由T4噬菌體的pseT基因編碼的一種蛋白質(zhì)，最初從T4噬菌體感染的E.coli中分離出來。作用：催化丫-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或者RNA的末端，不受底物分子鏈的長(zhǎng)短限制。3、來自于大腸桿菌bacterialalkalinephosphataseBAP或小牛腸calfintestinalalkalinephosphataseCIP,用于脫去DNARNA5末端的磷酸基團(tuán)，使5'-P成為5'-OH,該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接或環(huán)化

13、時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。五核酸外切酶第四章原核生物基因工程的載體重點(diǎn)：大腸桿菌質(zhì)粒載體,包括pBR322和pUC18/19載體構(gòu)建原理和應(yīng)用領(lǐng)域,藍(lán)/白篩選,質(zhì)粒DNA的制備和純化；入噬菌體載體，包才入gt10/11和入EMBL34載體構(gòu)建原理和應(yīng)用領(lǐng)域，入重組噬菌體的篩選；M13噬菌體載體，M13mp18/19構(gòu)建原理和應(yīng)用領(lǐng)域，單鏈DNA的制備；粘粒載體pJB8構(gòu)建原理和應(yīng)用領(lǐng)域。難點(diǎn)：入重組DNA的轉(zhuǎn)移和篩選一質(zhì)粒質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)攜帶的染色體外的DNA分子，是共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子covalentclosedcircular,DNAcccDNA>,大小在1200kb，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。

14、1、氯化銫密度梯度離心?質(zhì)粒DNA占總DNA的1%2%;在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；?染色劑溴化乙錠EB能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高,密度會(huì)越低。2、堿變性法?根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。?在pH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。?通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過離心去除線性染色體，獲

15、得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA3、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件?具有復(fù)制起點(diǎn)自我增殖的基本條件，一般具一個(gè)復(fù)制子。協(xié)助維持細(xì)胞內(nèi)含有1020個(gè)左右的質(zhì)?？截?具有抗菌素抗性?理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。以便為寄主細(xì)胞提供易于檢測(cè)的表型性狀做為選擇信號(hào),而且在有關(guān)的限制酶位點(diǎn)上插入外源DNA后形成的質(zhì)粒有一個(gè)選擇標(biāo)記。?具有若干限制酶切單一位點(diǎn)MCS；?具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。低分子量的質(zhì)粒易于操作,克隆外源片斷后不超過15kb仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因二噬菌體載體1

16、、入噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)1cos位點(diǎn)?線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12nt組成的彼此完全互補(bǔ)的5'突出單鏈?注入宿主后，粘性末端互補(bǔ)形成雙鏈區(qū)，成為cos位點(diǎn)。2、插入式載體?入噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。3、入替換型載體取代型載體外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段<20kb>高感染效率<109轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA,比質(zhì)粒高100倍替換型噬菌體入是使用最廣泛的載體。4、體外包裝入重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用由于入噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的75%或超過105%日t噬菌體

17、的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA48KB的75%105%左右的DNA,要求入載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度上限是51kb,必需基因?yàn)?8kb,外源極限在23kb。三噬菌粒?由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。?具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等,方便DNA的操作,可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；?具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn),在輔助噬菌體幫助下,可進(jìn)行噬菌體的繁殖,產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。四柯斯質(zhì)粒載體Cosmidvector?cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記?入噬菌體用于包裝的cos末端?載體在體外重組后,可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝,利用噬

18、菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。五單鏈DNA噬菌體載體M13、fl、fdM13是一種含單鏈+DNAssDNA的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈DNA片段，這種單鏈DNA片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測(cè)定DNA序列sanger雙脫氧法、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。M13噬菌體載體的寄主菌：由于M13噬菌體通過F因子編碼的菌毛進(jìn)入宿主細(xì)胞，故只能用雄性細(xì)菌來增殖病毒。注意比較載體的特點(diǎn)：六人工染色體隨著脈沖電泳技術(shù)的發(fā)展以及基因組研究的日益深入,對(duì)可插入大片段DNA的克隆載體

19、人工染色體的研究取得了迅速的發(fā)展所謂人工染色體一一是一類能在生物細(xì)胞中獨(dú)立"穩(wěn)定存在和遺傳的人工重組DNA分子"?酵母人工染色體載體yeastartificialchromosome,YAC,1000kb酵母染色體DNA自主復(fù)制順序ARS酵母染色體的著絲粒順序CEN酵母染色體的端粒順序TEL?細(xì)菌人工染色體bacterialartificialchromosome,BAC,300kb?哺乳類人工染色體MAC?P1衍生人工染色體第五章基因的分離、重組和鑒定基因的克隆,實(shí)質(zhì)上包含著待研究的目的基因的分離與鑒定兩個(gè)主要內(nèi)容,克隆步驟包括四個(gè)步驟用于基因克隆的DNA材料的選擇，及D

20、NA分子的片段化外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)將人工重組的DNA分子導(dǎo)入他們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞的程序?qū)χ亟M體分子的轉(zhuǎn)化子克隆進(jìn)行篩選一、基因組DNA的片段化1、利用限制酶片段化基因組DNA1鳥槍法shotgunapproch2隨機(jī)片段法構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí),最好采用隨機(jī)片段化的辦法制備克隆片段機(jī)械切割法、限制酶局部消化法二、外源DNA片段同載體分子的重組?主要依賴于核酸內(nèi)切酶與連接酶的作用，選擇外源DNA同載體三、重組子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑?原核生物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染：常用大腸桿菌K12突變體菌株喪失限制體系四重組子分子的選擇與鑒定1、遺傳檢測(cè)法2、物理檢測(cè)法3、菌落或噬菌斑雜交篩選法4

21、、免疫化學(xué)檢測(cè)法5、蛋白質(zhì)篩選法6、轉(zhuǎn)譯篩選法第六章基因克隆的策略從生物有機(jī)體中克隆某一特定DNA片段或基因的實(shí)驗(yàn)程序1、cDNA基因克隆cDNA文庫(kù)2、基因組DNA克隆DNA文庫(kù)3、基因定位克隆一cDNAlibraries的構(gòu)建二基因組DNA克隆?基因文庫(kù)genelibrary:用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機(jī)地連接在載體上,然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下,這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫(kù)?？寺』虻姆蛛x1、應(yīng)用核酸探針可以將基因文庫(kù)或者cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)移至硝

22、酸纖維素膜后，用特異性的探針同噬菌斑或者菌落進(jìn)行雜交,可以篩選出陽性克隆2、應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法差別雜交differentialhybridization,又稱差別篩選<differentialscreening>適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA的cDNAo扣除雜交subtractivehybridization,又叫扣除cDNA克隆subtractivecDNAcloning,通過構(gòu)建扣除文庫(kù)得以實(shí)現(xiàn)。抑制性扣除雜交：以抑制PCR為基礎(chǔ)的DNA扣除雜交方法3、應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)DDRT-PCR一般用20種隨機(jī)引物和12種3'-端錨定引物組成的全部240組引物對(duì)PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約20000條條帶,基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的mRNA。4、cDNA差式分析法RDA5、表達(dá)序列標(biāo)簽法ESTsESTSExpressedSequencetags是從已建好的cDNA庫(kù)中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5'末端或3末端對(duì)插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序,所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。6、基因表達(dá)系列分析法SAGE分離每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的特定位置的較短的單一的序列標(biāo)簽約9-14個(gè)堿基對(duì),SequenceTag,ST有確定一個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄物的足夠信息量。7、應(yīng)用表達(dá)文庫(kù)當(dāng)