常見提取總DNA,RNA的方法與注意事項

1、提RNA可是電泳后什么條帶都沒有，用的是REDzol,是因為細(xì)胞太 少了還是別的什么原因， 在加了氯仿后沒有出現(xiàn) 3 層，只有沉淀和上 清,是不是因為加氯仿到離心隔的時間太久了 參考見解：1、樣品量太?。?、操作時沒有嚴(yán)格按照提 RNA勺要求做，一般需要帶手套，最好帶 上口罩，所有塑料用品需要用DEPC處理并高壓，要在超凈臺上操作， 盡量不讓外源的RNA酶降解RNA3、 RNA電泳的電泳液和膠必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且要用DEPC處理，電 泳槽、制膠板先用蒸餾水洗滌然后用 75的酒精處理,還有,要單 獨一個槽子跑, 不要和其他膠一起跑。 跑膠時間控制在 10 分鐘左右。4、在加了氯仿后沒有出現(xiàn) 3 層

2、,只有沉淀和上清, 可能是加的氯仿量不合適,一般是按氯仿 /mlTrizol 加氯仿的。從加氯仿到離心隔的 時間對這個應(yīng)該沒有影響。5、在提完RNA后可以測0D直，如果0D直在之間，說明提的 RNA 比較純。RNA提取可不可以不用DEPC處理，多次滅菌（而不是長時間滅菌）也可以比較有效地滅活RNAse這種方法確實可行嗎參考見解：DEPC主要目的是防止RNA酶,其實還有很多其他的方法處 理器皿的，如氯仿沖洗，NaOH處理,高溫烘烤等另外兩次滅菌也可以 代替DEPC處理.提RNA勺關(guān)鍵在于：防止內(nèi)源性或外源性RNase降解 RNA對付外源性RNase有兩種辦法：能烤者烤，能泡者泡。比起其他的核酸實

3、驗來說，就多這么一步。其二、RNase分子內(nèi)部存在二硫鍵，一般條件變性后很快即可復(fù)性， 所以極為穩(wěn)定； 而且其作用條 件“簡單、快捷” 與絕大多數(shù)DNase不同，不需要二價陽離子即 可迅速發(fā)揮酶切作用。所以，要想長期保存RNA標(biāo)本，DEPC處理溶液、Tip頭等都是必不可少的。RNase一般高壓不能滅活，如果不用 DEPC勺話，快速提取，快速使用，不能貯藏。3 個關(guān)于乙醇單詞： ethanol ； alcohol ； mercaptoethanol ，他們的 主要區(qū)別是什么，可以互相代替嗎參考見解： ethanol 是乙醇的專業(yè)名詞，是用在醫(yī)學(xué)，工業(yè)等方面， 主要是指工業(yè)酒精。 alcohol

4、也是乙醇，酒精的意思，但是主要是用 在飲食行業(yè)的名詞。 mercaptoethanol 是巰基乙醇，不同于前兩種， 是另外一種物質(zhì)， 是一 種還原劑。RNA提取中DNA是怎么去掉的在哪一步呢 參考見解：在加入氯仿離心吸取上清的時候，注意不要吸到中間層。一般都要用DNase處理，即使吸不到中間層，也可能有 DNA虧染。 組織已經(jīng)低溫保存了一年多了，用來提 RNA可以嗎參考見解：液氮中保存應(yīng)該可以，但如果是在 -70C低溫冰箱中則可 能降解，建議在液氮中保存時盡量將組織塊切小，最好直徑在 1CM 之內(nèi)，有利于保存并方便下一步 RNA提取操作。當(dāng)然如果條件允許， 可以將組織塊放入 RNAlater

5、后低溫保存，只要普通冰箱即可，方便 且效果很好。提取血細(xì)胞的RNA但血凝很快，應(yīng)該注意什么問題是不是要加 EDTA用什么方法會更好參考見解：全血提DNA或 RNA要用抗凝血，可以用醫(yī)院里采血管，里面已經(jīng) 加了抗凝劑，或是自己配EDTAACD等來抗凝。EDTA抗凝用的溶液， 與血液之間體積比一般是 1:10 。ACD配方：單結(jié)晶水檸檬酸 （分子量），檸檬酸三鈉（分子量）， 單結(jié)晶水D-葡萄糖（分子量），順次溶于蒸餾水中，定容至1000ml, 過濾除菌。分裝后20°C保存?？鼓昧馨图?xì)胞分離液分離， 得到單核細(xì)胞后，再加入trizol等提取RNA步驟可按試劑盒操作 進(jìn)行。如果不分離單

6、核細(xì)胞， 血里面的紅細(xì)胞對提取有影響， 把紅細(xì) 胞破壞掉也可以。采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的有核細(xì)胞, 經(jīng)細(xì)胞裂解液處 理，上清提取RNA沉淀提取DNA用分離液分離所得紅細(xì)胞沉淀制 備血紅蛋白溶液。本法能從少量外周血中同時分離 RNA DNA及血紅 蛋白，高效易操作，值得推廣。怎樣能更有效的降低材料的降解參考見解：1、新鮮細(xì)胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么 降解幾乎都來自裂解液的用量不足。 如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中 裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。2、新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品 （如肝臟，胸腺等 ） ，即使 使用電動勻漿器勻漿也不能避免 RNA勺降解。更

7、可靠的方法是：在液 氮條件下將組織研碎，并且勻漿時使用更多裂解液。3、冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至 -70C 冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于 -70C冰箱中。冷 凍樣品， 即使是冷凍細(xì)胞， 如果不在液氮條件下研磨碎， 而直接加入 裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分 接觸前決不能出現(xiàn)融化， 所以研磨用具必須預(yù)冷， 在碾磨過程中要及 時補(bǔ)充液氮。 樣品研碎后， 在液氮剛剛揮發(fā)完時， 將樣品迅速轉(zhuǎn)移到 含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。4、外源RNA酶的污染：試劑，器械及實驗環(huán)境中的RNA酶進(jìn)入實驗 系統(tǒng)。5、內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失

8、效或者用量不夠，實驗樣品過多； 勻漿時溫度過高。OD260/OD28比值偏低參考見解：1、蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量， 確保裂解完全、 徹底。加入氯仿后首先要充分混勻， 并且離心分層的 離心力和時間要足夠。如果所得RNA勺OD260/OD28比值偏低，貝卩用 氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2、苯酚殘留： 確保不要吸入中間層及有機(jī)相。 加入氯仿后首先要充 分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。3、多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量 較多，這些殘留也會導(dǎo)致OD260/OD28比值偏低。因此，從這類材料 中提取RNA寸，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。4、設(shè)備限制：測定OD26C及OD28Q數(shù)值時，要使OD260賣數(shù)在之間。 此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測 0D值時，對照及樣品稀釋液請 使用10mM Tris，。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。RNA提取得率低參考見解：1、該