消化毒劑的作用機理 農藥毒理學 教學

1、編輯課件第七節(jié)第七節(jié) 消化毒劑的作用機理消化毒劑的作用機理 1996年，吳文君等首次提出了年，吳文君等首次提出了消化毒劑消化毒劑的概念，把主要作的概念，把主要作用于昆蟲消化系統(tǒng)，用于昆蟲消化系統(tǒng)，即主要以消化系統(tǒng)為初始靶標的殺蟲劑為即主要以消化系統(tǒng)為初始靶標的殺蟲劑為消化毒劑。消化毒劑。 破壞破壞中腸中腸 中腸組織破壞劑中腸組織破壞劑 影響影響消化酶系消化酶系 消化抑制劑。消化抑制劑。 主要種類：主要種類： Bt內毒素內毒素 植物源次生代謝物植物源次生代謝物，如二氫沉香呋喃類化合物等。，如二氫沉香呋喃類化合物等。 兩類靶標兩類靶標編輯課件一、一、 Bt內毒素內毒素 蘇云金桿菌（蘇云金桿菌（Ba

2、cillus thuringiensis,Bt），產品已達），產品已達60余種，余種，是世界上產量最大、應用最廣泛的微生物殺蟲劑。是世界上產量最大、應用最廣泛的微生物殺蟲劑。 基本作用原理基本作用原理 BtBt的殺蟲活性主要是其產生的的殺蟲活性主要是其產生的殺蟲蛋白晶體殺蟲蛋白晶體在起作用。殺蟲在起作用。殺蟲蛋白晶體，也叫蛋白晶體，也叫原毒素原毒素（protoxinprotoxin），是由多個殺蟲晶體蛋白），是由多個殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPsinsecticidal crystal proteins,ICPs）或）或-內毒素內毒素（-en

3、dotoxinendotoxin）或）或CryCry（晶體）蛋白的亞單位組成。昆蟲攝食該毒蛋（晶體）蛋白的亞單位組成。昆蟲攝食該毒蛋白后，在中腸的高白后，在中腸的高pHpH環(huán)境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶體溶解并環(huán)境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶體溶解并被激活，引起試蟲中腸膜上皮細胞裂解。被激活，引起試蟲中腸膜上皮細胞裂解。癥狀：癥狀： 試蟲失去運動能力，不停地顫抖，嘔吐，停止取食，死亡試蟲失去運動能力，不停地顫抖，嘔吐，停止取食，死亡。 編輯課件編輯課件1. Bt殺蟲晶體蛋白（殺蟲晶體蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs） 殺蟲晶體蛋白是由蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體

4、蛋白是由蘇云金芽胞桿菌( ( Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis ，Bt)Bt)所產生的毒素。所產生的毒素。 毒蛋白主要有毒蛋白主要有7 7種種：A2A2外毒素、外毒素、B2B2外毒素、外毒素、C2C2外毒外毒素、素、- -內毒素內毒素、不穩(wěn)定外毒素、水溶性毒素、鼠因子、不穩(wěn)定外毒素、水溶性毒素、鼠因子外毒素。外毒素。 - -內毒素內毒素是在形成芽孢的同時形成的蛋白質晶體，是在形成芽孢的同時形成的蛋白質晶體，位于芽孢之旁，所以又稱位于芽孢之旁，所以又稱伴孢晶體毒素伴孢晶體毒素，是主要的殺，是主要的殺蟲晶體蛋白，這種晶體蛋白只是一種前毒素蟲

5、晶體蛋白，這種晶體蛋白只是一種前毒素(Pretoxin)(Pretoxin)，經過激活，即消化成分子量為，經過激活，即消化成分子量為100010007000070000的片段，才起毒素作用。的片段，才起毒素作用。編輯課件 晶體蛋白有晶體蛋白有130130多種，按照殺蟲范圍和寄主同源型多種，按照殺蟲范圍和寄主同源型又可分為兩大類群，即又可分為兩大類群，即CryCry 蛋白蛋白和和CytCyt蛋白蛋白。 CryCry在活體和離體條件下只對鱗翅目、雙翅目或鞘在活體和離體條件下只對鱗翅目、雙翅目或鞘翅目有效；翅目有效； CytCyt活體條件下只對雙翅目有效，而離體條件下具活體條件下只對雙翅目有效，而離

6、體條件下具有廣譜性。有廣譜性。 CryCry分為四大類（分為四大類（根據(jù)殺蟲譜）：根據(jù)殺蟲譜）：CryCryI I（鱗翅目）、（鱗翅目）、CryCryII(II(鱗翅目和雙翅目鱗翅目和雙翅目) )、CryCryIIIIII（鞘翅目）和（鞘翅目）和CryCryIV(IV(雙翅目雙翅目) )。 通常一種毒素只能殺死某一目的部分易感昆蟲，通常一種毒素只能殺死某一目的部分易感昆蟲，對有益生物和脊椎動物安全。對有益生物和脊椎動物安全。1. Bt殺蟲晶體蛋白（殺蟲晶體蛋白（ICPs）編輯課件 完整的毒蛋白一般由完整的毒蛋白一般由三個結構域三個結構域組成。組成。 結構域結構域由一個由一個- -螺旋束組成，可

7、能螺旋束組成，可能與細胞膜與細胞膜穿孔穿孔有關；有關； 結構域結構域由三組由三組- -折疊片層組成，可能折疊片層組成，可能參與了參與了毒素與膜受體蛋白的識別和結合毒素與膜受體蛋白的識別和結合； 結構域結構域位于毒素分子位于毒素分子C-C-端，則可能端，則可能能夠防止昆能夠防止昆蟲腸道蛋白酶對毒性肽分子的進一步降解蟲腸道蛋白酶對毒性肽分子的進一步降解。 1. Bt殺蟲晶體蛋白（殺蟲晶體蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）編輯課件編輯課件2. Bt毒素受體蛋白毒素受體蛋白 晶體蛋白的毒性與受體蛋白和晶體蛋白結合的能力晶體蛋白的毒性與受體蛋白和晶體蛋白結合的能力

8、呈正相關，呈正相關，膜受體蛋白是毒蛋白專一性的決定因子膜受體蛋白是毒蛋白專一性的決定因子。 昆蟲中腸昆蟲中腸BtBt毒素受體蛋白主要為存在中腸的刷狀毒素受體蛋白主要為存在中腸的刷狀緣膜囊泡緣膜囊泡(BBMV)(BBMV)的的氨肽酶氨肽酶N N (aminopeptidase N (aminopeptidase N，APN)APN)（肽鏈端解酶，催化蛋白氨基末端殘基的分裂（肽鏈端解酶，催化蛋白氨基末端殘基的分裂 ）。鱗翅）。鱗翅目。目。 煙草天蛾中腸煙草天蛾中腸BBMVBBMV上上CryCry1Ab1Ab毒素的受體毒素的受體BT-R1BT-R1，證明它是一種證明它是一種類鈣粘蛋白類鈣粘蛋白(ca

9、dherin-like)(cadherin-like)。 尖音庫蚊幼蟲中腸中球形芽孢桿菌晶體的尖音庫蚊幼蟲中腸中球形芽孢桿菌晶體的BinBin毒素毒素受體可能是一種受體可能是一種- -葡糖苷酶葡糖苷酶。 編輯課件 - -內毒素的作用過程要經溶解、酶解活化、與受體內毒素的作用過程要經溶解、酶解活化、與受體結合、插入、孔洞或離子通道形成等五個環(huán)節(jié)。結合、插入、孔洞或離子通道形成等五個環(huán)節(jié)。昆蟲取食孢子和毒素昆蟲取食孢子和毒素毒素被蛋白酶活化毒素被蛋白酶活化毒素與膜受體結合毒素與膜受體結合毒素造成膜穿孔使細胞裂解毒素造成膜穿孔使細胞裂解3. 3. 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理編輯課件

10、 毒素的溶解毒素的溶解 晶體蛋白可以溶解于晶體蛋白可以溶解于pH 12pH 12或或pH 9.5pH 9.5并加有巰并加有巰基試劑的堿性溶液中。中腸內環(huán)境諸如基試劑的堿性溶液中。中腸內環(huán)境諸如pHpH值、還原電值、還原電勢、去垢性、體積等都可能影響勢、去垢性、體積等都可能影響- -內毒素在昆蟲體內毒素在昆蟲體內的溶解性。鱗翅目幼蟲的中腸內的溶解性。鱗翅目幼蟲的中腸pHpH值一般都較高，呈值一般都較高，呈堿性堿性, , 對對- -內毒素的溶解很有利。內毒素的溶解很有利。3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 編輯課件 毒素的活化毒素的活化 溶解的晶體蛋白被中腸蛋白酶水解，由溶解的晶

11、體蛋白被中腸蛋白酶水解，由130kD130kD左右的前毒素，打開二硫鍵，釋放出左右的前毒素，打開二硫鍵，釋放出N N 端的端的70kD70kD左右的左右的抗酶多肽活力片段抗酶多肽活力片段。 活力片段活力片段至少由兩部分組成至少由兩部分組成, , 即即毒力片段毒力片段和和細胞結細胞結合片段合片段。毒力片段位于。毒力片段位于N N端端, , 由幾個保守的親水區(qū)組成，由幾個保守的親水區(qū)組成，主要結構是主要結構是- -螺旋，對于螺旋，對于跨膜通道的形成及毒效跨膜通道的形成及毒效可能起可能起著重要作用。著重要作用。細胞結合片段細胞結合片段由由C C端的保守區(qū)和中間的可變端的保守區(qū)和中間的可變區(qū)組成，主要

12、結構是區(qū)組成，主要結構是- -片層，負責片層，負責毒素與靶標昆蟲受體毒素與靶標昆蟲受體的結合的結合，從而決定了毒素的選擇性。中腸酶液的組成直，從而決定了毒素的選擇性。中腸酶液的組成直接影響到接影響到- -內毒素的降解活化內毒素的降解活化, , 對對- -內毒素作用的專內毒素作用的專一性起著重要作用。一性起著重要作用。 3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 編輯課件毒蛋白的活化過程毒蛋白的活化過程被昆蟲取食的晶體蛋白被昆蟲取食的晶體蛋白在中腸被溶解在中腸被溶解堿性環(huán)境堿性環(huán)境成熟毒素成熟毒素被中腸蛋白酶消化活化被中腸蛋白酶消化活化毒素的活化毒素的活化 3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機

13、理殺蟲晶體蛋白的作用機理 編輯課件3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 毒素與受體蛋白的結合毒素與受體蛋白的結合 毒素被活化以后，毒素首毒素被活化以后，毒素首先是通過結構域先是通過結構域與上皮細胞膜上的受體蛋白發(fā)生專與上皮細胞膜上的受體蛋白發(fā)生專一性結合。一性結合。結合分為兩步結合分為兩步，第一步即，第一步即初始結合初始結合( Initial Binding)( Initial Binding)，結合上的毒素可以再次與受體，結合上的毒素可以再次與受體發(fā)生解離，故又稱發(fā)生解離，故又稱可逆性結合可逆性結合(Reversible Binding)(Reversible Binding

14、)；初始結合之后，毒素進一步與膜受體蛋白發(fā)生緊密結初始結合之后，毒素進一步與膜受體蛋白發(fā)生緊密結合或直接插入細胞膜合或直接插入細胞膜, ,此時的毒素與受體難以發(fā)生解離此時的毒素與受體難以發(fā)生解離, ,故為故為不可逆性結合不可逆性結合( Irreversible Binding)( Irreversible Binding)。 編輯課件 插入及孔洞或離子通道的形成插入及孔洞或離子通道的形成 活化的毒素與刷狀活化的毒素與刷狀緣膜上的受體結合后，結構域緣膜上的受體結合后，結構域插入膜內，形成孔洞插入膜內，形成孔洞或離子通道，導致膜完整性的破壞，引起離子滲漏，或離子通道，導致膜完整性的破壞，引起離子滲

15、漏，水隨之進入細胞，細胞因膨脹而解體、死亡。水隨之進入細胞，細胞因膨脹而解體、死亡。 3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 編輯課件(+)結構域結構域 I- -螺旋束螺旋束 編輯課件3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 結構域結構域在殺蟲蛋白中的作用在殺蟲蛋白中的作用 CryCry蛋白的結構域蛋白的結構域是由是由6-76-7個兩親的個兩親的-螺旋圍繞著一個疏水的中心螺旋螺旋圍繞著一個疏水的中心螺旋形成的。定點突變結果表明形成的。定點突變結果表明, , 結構域結構域可能是通過自身的帶正電荷殘基與帶負電荷的膜表面接觸的。對可能是通過自身的帶正電荷殘基與帶負電荷的膜表

16、面接觸的。對于結構域于結構域在膜上形成穿孔的機制，認為是結構域在膜上形成穿孔的機制，認為是結構域IIII在完成毒素在完成毒素- -受體識別后，受體識別后，結構域結構域受毒素受毒素- -受體結合的誘導要發(fā)生重大構象受體結合的誘導要發(fā)生重大構象變化，周圍的兩親變化，周圍的兩親-螺旋向外翻，由螺旋向外翻，由-4-4螺旋與螺旋與-5-5螺旋構成螺旋構成的的“軸軸”突出，突出，4 4個毒素分子的個毒素分子的-5-5螺旋相互靠近形成孔道的內螺旋相互靠近形成孔道的內壁，而壁，而4 4個個-4-4螺旋則形成孔道的外壁，孔道穿透整個磷脂雙層，螺旋則形成孔道的外壁，孔道穿透整個磷脂雙層，細胞外的水大量內流，導致細

17、胞脹裂。細胞外的水大量內流，導致細胞脹裂。 編輯課件-5螺旋螺旋-4螺旋螺旋-5螺旋螺旋細胞膜細胞膜-4螺旋螺旋細胞膜細胞膜圖圖2 Bt殺蟲毒蛋白作用的傘型模型與形成孔道原理示意圖殺蟲毒蛋白作用的傘型模型與形成孔道原理示意圖H2O編輯課件3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 結構域結構域由由3 3個個- -折疊片層組折疊片層組成，主要成，主要進行毒素與受體蛋白的特進行毒素與受體蛋白的特異性識別異性識別。在每個片層的頂端各有。在每個片層的頂端各有一個突環(huán)。毒素與受體的作用主要一個突環(huán)。毒素與受體的作用主要是通過這些突環(huán)與受體蛋白識別、是通過這些突環(huán)與受體蛋白識別、并進一步不可逆結

18、合的。突環(huán)上氨并進一步不可逆結合的。突環(huán)上氨基酸組成和殘基的帶電性、側鏈大基酸組成和殘基的帶電性、側鏈大小及疏水性等對毒素與受體的專一小及疏水性等對毒素與受體的專一性結合都有影響，刪除突環(huán)或改變性結合都有影響，刪除突環(huán)或改變突環(huán)上殘基的性質都會導致毒素與突環(huán)上殘基的性質都會導致毒素與受體結合能力的嚴重喪失。受體結合能力的嚴重喪失。 結構域結構域II -片層上的突環(huán)片層上的突環(huán)結構域結構域在毒素在毒素- -受體結合中的作用受體結合中的作用編輯課件3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 結構域結構域在毒素在毒素- -受體結合中的作用受體結合中的作用 結構域結構域是由是由兩組反平行的兩

19、組反平行的- -折疊片層組成的三明治結構。折疊片層組成的三明治結構。 通過交換不同毒素的通過交換不同毒素的結構域結構域發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn), ,該結構域對毒該結構域對毒素的殺蟲專一性有一定影響。素的殺蟲專一性有一定影響。 結構域結構域也參與了毒素也參與了毒素與受體的結合。與受體的結合。 結構域結構域與受體結合及離子通道活性的調節(jié)有關。與受體結合及離子通道活性的調節(jié)有關。編輯課件 不同品系的不同品系的BtBt由于產生的由于產生的CryCry蛋白類型不同，不蛋白類型不同，不僅殺蟲譜不同，而且很可能擁有不同的作用方式?？們H殺蟲譜不同，而且很可能擁有不同的作用方式?？傊?，之，BtBt內毒素在進入昆蟲中腸后，先是在

20、堿性條件下內毒素在進入昆蟲中腸后，先是在堿性條件下溶解，然后被活化為小分子多肽溶解，然后被活化為小分子多肽, ,再與中腸內膜上的再與中腸內膜上的刷緣狀膜小泡（刷緣狀膜小泡（BBMVBBMV）中特異受體結合，毒素分子插）中特異受體結合，毒素分子插入質膜形成一個微孔，陽離子和小分子滲入，這些微入質膜形成一個微孔，陽離子和小分子滲入，這些微孔因滲透腫脹而變大，最終細胞破裂。昆蟲中腸上皮孔因滲透腫脹而變大，最終細胞破裂。昆蟲中腸上皮細胞死亡，腸壁受損，腸道內容物進入血淋巴，直接細胞死亡，腸壁受損，腸道內容物進入血淋巴，直接造成血淋巴造成血淋巴pHpH值上升可使昆蟲麻痹死亡；值上升可使昆蟲麻痹死亡；毒性

21、肽進入毒性肽進入血淋巴可使昆蟲患毒血癥死亡；活細胞或孢子進入血血淋巴可使昆蟲患毒血癥死亡；活細胞或孢子進入血腔可使昆蟲患敗血癥死亡。腔可使昆蟲患敗血癥死亡。 3 3 殺蟲晶體蛋白的作用機理殺蟲晶體蛋白的作用機理 編輯課件編輯課件二氫沉香呋喃類化合物：二氫沉香呋喃類化合物：苦皮藤素苦皮藤素、等可致等可致粘蟲：中腸柱狀細胞的微絨毛排列不整齊，大量脫落；粘蟲：中腸柱狀細胞的微絨毛排列不整齊，大量脫落；基膜內褶空間變大，排列紊亂；細胞質密度降低；內基膜內褶空間變大，排列紊亂；細胞質密度降低；內質網(wǎng)極度擴張質網(wǎng)極度擴張 ，囊泡化，核糖體脫落；線粒體嵴模糊，囊泡化，核糖體脫落；線粒體嵴模糊不清楚，雙層膜不

22、完整。推測其機理為：此類化合物不清楚，雙層膜不完整。推測其機理為：此類化合物與昆蟲中腸細胞膜及內膜結合，膜系統(tǒng)結構發(fā)生改變，與昆蟲中腸細胞膜及內膜結合，膜系統(tǒng)結構發(fā)生改變，水分和各種離子的通透性隨之改變，引起細胞腫脹、水分和各種離子的通透性隨之改變，引起細胞腫脹、失水、瓦解，最終死亡。推測其機理為：失水、瓦解，最終死亡。推測其機理為：此類化合物此類化合物與昆蟲中腸細胞膜及內膜結合，膜系統(tǒng)結構發(fā)生改變，與昆蟲中腸細胞膜及內膜結合，膜系統(tǒng)結構發(fā)生改變，水分和各種離子的通透性隨之改變，引起細胞腫脹、水分和各種離子的通透性隨之改變，引起細胞腫脹、失水、瓦解，最終死亡。失水、瓦解，最終死亡。 二、其他消化毒劑二、其他消化毒劑編輯課件饑餓對照饑餓對照處處 理理正常對照正常對照脫氧鬼臼毒素對菜青蟲組織結構的影響脫氧鬼臼毒素對菜青蟲組織結構的影響渾濁潰爛狀渾濁潰爛狀腸道內無食物殘腸道內無食物殘渣，呈黃色透明渣，呈黃色透明鬼臼毒素類化合物鬼臼毒素類化合物 編輯課件CK12h24h72h48h36h組織學觀察結果：組織學觀察結果：中腸圍食膜逐漸消融，幾乎完全消失。中腸圍食膜逐漸消融，幾乎完全消失。編輯課件對照試蟲中腸對照試蟲中腸饑餓試蟲中腸饑餓試蟲中腸處理試蟲中腸處理試蟲中腸CK中腸完好中腸完好,厚度較均