9第六章魚病檢測技術(shù)

1、7、我國魚類寄生蟲與寄生蟲病研究進展、我國魚類寄生蟲與寄生蟲病研究進展50年前，某些魚類寄生蟲門類的零星記載50-70年代： 最早研究：鯉隱鞭蟲（Cryptobia branchialis Nie 1955）草魚苗和夏花魚苗（當時此病在江蘇、浙江養(yǎng)魚地區(qū)流行，數(shù)天內(nèi)草魚大量死亡） 多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifilis）（倪達書等（1960）對其形態(tài)、生活史等作了詳細研究。危害淡水養(yǎng)殖魚類。世界性魚病。）粘孢子蟲?。∕yxobolus artus Achmerov. 1960） 寄生草魚魚種腸道（前腸許多胞囊），死亡率80-90%（Myxobolus drjagin

2、irtus Achmerov. 1954） 瘋狂病、瘋刀兒。其營養(yǎng)體寄生于鰱神經(jīng)系統(tǒng)和感覺器官（Myxosoma cerebralis Hofer 1903） “昏旋病” （Whirling disease）類似瘋狂病，旋轉(zhuǎn)、脊柱彎曲。 歐洲、美洲及亞洲流行尤其在北美洲對鮭鱒魚危害很大蠕蟲?。蜗枞A等，1956年）： 形態(tài)分類，生活史，防治方法，開拓性研究。草魚魚種腸道，引起大量死亡。流行于兩廣，后來在華東地區(qū)也發(fā)現(xiàn)。草魚引進歐洲后，也在歐洲發(fā)現(xiàn)。（潘金培等，1963年）：囊蚴寄生在多種淡水魚（鰱、鳙）眼睛水晶體內(nèi)，白內(nèi)障。世界廣泛流行。（左文功等1974年）：寄生在草魚腸道（唐仲璋等1975

3、年）：成蟲寄生于多種淡水魚心臟和動脈球。可引起大量死亡。甲殼動物：1979年，潘金培等發(fā)現(xiàn)，魚種感染一定數(shù)量的貓頭鳋，蟲體自然脫落后，魚能獲得免疫力，免疫效果可達一年以上。：黃琪琰80年代初期1962年，中國科學院水生生物研究所組織全國有關(guān)科技人員，對湖北全省進行了魚類寄生蟲的區(qū)系調(diào)查，1973年編寫了湖北省魚病病原區(qū)系圖志，對推動我國寄生蟲區(qū)系研究有相當?shù)淖饔茫S富了我國魚類寄生蟲區(qū)系的組成，發(fā)現(xiàn)新魚類寄生蟲種類。1990年，華南師大潘炯華、張劍英等魚類寄生蟲學1998年，陳啟鎏、馬成倫專著中國動物志粘體動物門粘孢子綱，是迄今為止世界上唯一的一本魚類寄生粘孢子蟲志。1999年，張劍英等魚類寄

4、生蟲與寄生蟲病2003年，宋微波海水養(yǎng)殖中的危害性原生動物，國內(nèi)第一部較全面涉及海水養(yǎng)殖危害性原生動物研究的專著。2007年，宋微波等譯原生生物學Protistology（K Hausmann），當今本領(lǐng)域最新研究成果的教科書式專著。寄生蟲的形態(tài)學、分類學研究： 普通光學顯微鏡、解剖鏡結(jié)合生物染色技術(shù)，外觀形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)描述。 電子顯微鏡亞顯微結(jié)構(gòu) 細胞生物學及分子生物學方法對核糖體小亞單位DNA測序，形成新的分類依據(jù)與分類系統(tǒng)魚類寄生蟲免疫的研究 免疫原性 免疫應答 免疫診斷 免疫治療免疫原性 魚類寄生蟲（機體的異物） 魚類非特異性免疫反應 特異性免疫反應 寄生蟲免疫原性決定魚類特異性免疫反

5、應發(fā)生。 寄生蟲個體大，寄生的部位因種類而不盡相同，研究免疫原性（確定抗原物質(zhì)、抗原決定簇）存在難度。 寄生蟲免疫原性研究集中在原生動物上，包括： 免疫原性物質(zhì) 是否具有種屬特異性抗原 是否具有特異性抗原 在整個生活史中是否具有某些共同抗原。免疫應答 非特異性免疫 誘導魚類非特異性免疫免疫因子（粘液、吞噬細胞、補體）； 產(chǎn)生炎癥反應：液體成分，細胞成分滲出； 魚類的非特異性免疫反應對魚體僅起著介導性保護的作用。 特異性免疫 相對于病毒和細菌，寄生蟲結(jié)構(gòu)復雜，對其誘導魚類特異性免疫研究困難。寄生蟲誘導魚類產(chǎn)生特異性免疫，報導較少。 Yoshinaga1997，刺激隱核蟲（Cryptocaryon

6、 irritans）纖毛幼蟲免疫底鱂（Fundulus heteroclitus）能產(chǎn)生抗血清。該血清在底滴度時，纖毛幼蟲游泳緩慢并發(fā)生聚集；在高滴度時，纖毛幼蟲聚積成團并停止運動。用刺激隱核蟲攻擊經(jīng)過免疫的魚，3-4天后觀察，免疫魚不被感染，而未經(jīng)免疫的魚均被感染。證明，底鱂經(jīng)刺激隱核蟲誘導后可產(chǎn)生抗體，獲得免疫保護力。免疫診斷 以特異性抗原抗體反應為基礎(chǔ)進行診斷。 存在的問題 a.生活史中，期特異性性抗原的存在，對寄生蟲整個生活史的診斷難度增大； b.生活史中，共同抗原的存在，對生活史特定階段的診斷難度增大； c.屬特異性抗原的存在，使檢測易于出現(xiàn)交叉反應。 免疫學診斷是今后寄生蟲病診斷具

7、有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?，尤其是利用特異性的單克隆抗體進行各種標記檢測（IFAT、ELISA）等，在應用上具有比較廣闊的發(fā)展前景。免疫治療 寄生蟲免疫學研究目的：實現(xiàn)對寄生蟲病的免疫治療。 目前魚類寄生蟲免疫研究處于比較低的水平，有關(guān)免疫治療的研究報導寥寥無幾。疫苗的研究距離產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和實際應用還有相當長的距離。 小瓜蟲疫苗（用于防治魚類纖毛蟲病僅有的一種疫苗） 兩種類型：死疫苗（經(jīng)冷凍和福爾馬林處理） 活疫苗（直接用活體小瓜蟲） 活疫苗免疫效果較好：Burkart（1990）等用小瓜蟲活纖毛幼蟲成功地免疫了鲇魚，魚體免疫保護可持續(xù)13個月。習題寄生蟲、寄主和外界環(huán)境三者的相互關(guān)系如何？第一節(jié)第一節(jié)

8、免疫學檢測免疫學檢測第二節(jié)第二節(jié) 基于核酸操作的分子生物學診基于核酸操作的分子生物學診 斷技術(shù)斷技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 免疫學檢測免疫學檢測一、一、 Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點反應的一般規(guī)律和特點二、二、 Ag-Ab反應的影響因素反應的影響因素三、主要的三、主要的Ag-Ab反應反應 免疫學檢測是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的特點，應用免疫學的理論設(shè)計出來的診斷各種疾病和測定動物免疫狀態(tài)的方法與技術(shù)?？乖c相應抗體在體外發(fā)生的特異性結(jié)合反應;抗原與相應抗體在體內(nèi)發(fā)生的特異性結(jié)合反應;抗原與相應抗體在體外或體內(nèi)發(fā)生的特異性結(jié)合反應一、一、 Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點反應的一般規(guī)律和特點（一）特異性與交

9、叉性（二）可逆性（三） Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象” Ag - Ab結(jié)合需有適當比例-最適比，形成的結(jié)合物體積大、數(shù)量多，出現(xiàn)肉眼可見的反應。即Ag - Ab反應的等價帶。 若Ag 或Ab過多，比例不適，不能出現(xiàn)肉眼可見反應-“帶現(xiàn)象” Ab過剩-前帶， Ag 過剩-后帶。（四）特異性結(jié)合與反應可見兩個階段時間短（數(shù)秒），不可見慢（數(shù)分至數(shù)天），有凝集、沉淀等（五）高度敏感性：血清中和試驗可用于檢測含量低至10-3 g / ml的魚類病毒； ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)可檢測含量為10-3 g / ml的細菌性病原二、影響二、影響Ag-Ab反應的主要因素反應的主要因素1、電解質(zhì)：生理鹽水

10、（0.85%NaCl ）2、溫度：37，水產(chǎn)動物2830 3、PH：68三、主要的抗原抗體反應三、主要的抗原抗體反應（一）凝集反應（ Agglutination）1. 定義：定義：顆粒性抗原一定條件下，經(jīng)過一定時間形成肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應。凝集原凝集素2. 種類種類:(1)直接凝集反應直接凝集反應(direct agglutination) ：玻片法：試管法：玻片法：定性玻片法：定性反應陽性 反應陰性 (2) 間接凝集反應間接凝集反應(indirect or passive agglutination) ：間接血凝試驗、間接乳凝試驗和間接炭凝試驗（3）間接凝集抑制試驗）間接凝集抑制試

11、驗 可溶性Ag + 相應Ab + 相應致敏顆粒不出現(xiàn)致敏顆粒凝集 可用來檢測可溶性Ag（4）協(xié)同凝集試驗）協(xié)同凝集試驗 金黃色葡萄球菌細胞壁中的蛋白A（SPA）+IgG暴露Fab片段+相應Ag協(xié)同凝集反應 通常可用于檢測可能存在的微量抗原 目前，已用于流腦、傷寒、布氏菌病的早期診斷（二）沉淀反應(precipitation)1. 定義：定義：可溶性抗原用于沉淀反應的抗原稱為沉淀原；用于沉淀反應的抗體稱沉淀素 沉淀反應包括環(huán)狀沉淀反應、絮狀沉淀反應以及由此派生出來的瓊脂免疫擴散試驗等。其中，前兩者因其敏感性不高，已被淘汰。瓊脂免疫擴散方法現(xiàn)仍廣泛應用。瓊脂免疫擴散（immunodiffusion

12、） 1%-2%（w/v）的瓊脂和瓊脂糖有一定的強度，并含有較大的微孔。凝膠允許分子量小于200000的抗體和抗原在凝膠中自由擴散，抗原抗體由近及遠形成濃度梯度，當二者在比例適當處相遇時，即發(fā)生抗原抗體沉淀反應?？乖贵w復合物因其顆粒大而不能再在凝膠中擴散并形成沉淀帶。此種反應稱為瓊脂免疫擴散。包括單向瓊脂擴散試驗、雙向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散將已知抗體與瓊脂混勻特點：操作繁瑣雙向瓊脂擴散 定性檢測可溶性Ag或Ab； 對復雜的Ag、Ab的提取純度進行分析鑒定。（三）與補體相關(guān)的試驗1、溶解試驗、溶解試驗（1）溶血試驗 紅細胞與相應抗體（溶血素）結(jié)合，通過激活補體使紅細胞溶解（2）溶菌試驗 某些細

13、菌與相應Ab結(jié)合，可激活補體，使細菌溶解2、補體結(jié)合試驗（、補體結(jié)合試驗（CFT） 是一種在補體參與的條件下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來測定有無相應抗原或抗體的血清學試驗。AgAgAgAbAbAbCCCSRBCSRBCSRBCHHH_溶血（反應陰性）溶血（反應陰性）不溶血（反應陽性）待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)補體結(jié)合反應的基本原理Red blood cells without (left and middle) and with (right) hemolysis. Note that the hemolyzed sample is transparent, because there are

14、no cells to scatter light.(四)現(xiàn)代免疫標記技術(shù)（immunolabelling technique） 定義：定義：將抗原或抗體用熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等加以標記，以提高抗原抗體反應以及抗原或抗體檢測靈敏度的一類新技術(shù)。 免疫標記技術(shù)敏感性高、特異性強、應用范圍廣 (抗原或抗體定量、定性、定位)1、免疫熒光技術(shù)（、免疫熒光技術(shù)（immunofluorecence technique）（1） 定義：用熒光物標記抗體或抗原來檢測細胞或組織中相應抗原或抗體的技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)。（2）熒光物種類：異硫氰酸熒光素、羅丹明熒光素、二氯三嗪基氨基熒光素等（3）種

15、類：包括直接法、間接法和補體法 b、 c、 d、圖1為的陰性對照。圖2為直接法檢測人工感染W(wǎng)SSV的螯蝦鰓絲圖3為直接法檢測患淋巴囊腫病毒病的牙鲆囊腫組織圖4中A為對蝦WSSV抗體芯片檢測結(jié)果 B為魚類LCDV抗體芯片檢測結(jié)果AB圖1圖2圖3圖42、免疫酶技術(shù)、免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic technique)ELISA 抗原（抗體）+ 酶標抗體（抗原） 特異性高；敏感性低 用已知Ag檢測未知Ab的效價。 已知Ag吸附于載體，洗滌 加被檢血清，Ab與Ag結(jié)合，洗滌 加酶標二抗，使與Ag-Ab復合物結(jié)合，洗滌 加底物顯色 敏感性高；易非特異性吸附 用已知Ab檢測未知Ag。 已知Ab

16、吸附于載體，洗滌 加可能含Ag的待檢溶液，洗滌 加酶標記Ab，洗滌 加底物適用于含兩個以上表位的抗原兩種抗體芯片對不同濃度殺鮭氣單胞菌的檢測（細菌濃度單位：兩種抗體芯片對不同濃度殺鮭氣單胞菌的檢測（細菌濃度單位：cfu/ml）1010108106104109107105103兩種抗體芯片對不同濃度海分支桿菌的檢測（細菌濃度單位：兩種抗體芯片對不同濃度海分支桿菌的檢測（細菌濃度單位：cfu/ml）10101081061041091071051033、放射免疫測定技術(shù)、放射免疫測定技術(shù) (Radioimmunoassay, RIA) 4、免疫電鏡技術(shù)、免疫電鏡技術(shù) 該技術(shù)是一種在分子水平上的抗原定

17、位法，實際上是將細胞水平的熒光抗體技術(shù)的原理應用到分子水平上。此項技術(shù)在細胞抗原成分的定位、識別以及細胞形態(tài)和功能關(guān)系的研究上，已成為重要的方法。主要用于病毒、細菌等抗原定位、免疫性疾病的發(fā)病機理及超微結(jié)構(gòu)免疫細胞化學研究等。 環(huán)氧樹脂包埋后膠體金法電鏡圖。顯示抗原存在部位(箭頭所示)第二節(jié)第二節(jié) 基于核酸操作的分子生物學診斷技術(shù)基于核酸操作的分子生物學診斷技術(shù)1、聚合酶鏈式反應（、聚合酶鏈式反應（PCR） PCR技術(shù)自80年代初發(fā)明以來迅速成為分子生物學研究的常用手段，它是模仿生物體內(nèi)DNA復制，利用DNA聚合酶依賴于DNA模板特性，人工合成兩個與預定擴增片段中一短序列互補的引物，從而引發(fā)四

18、種脫氧核糖核苷酸的聚合反應。一般包括DNA變性、退火、延伸三個基本反應步驟：（1）模板DNA的變性，模板DNA在95左右形成單鏈DNA而游離于溶液；（2）模板DNA與引物的退火（復性），引物多于模板的情況下，引物突然降溫與對應模板DNA鏈局部互補形成雜交鏈；（3）引物的延伸，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的“半保留復制鏈”，重復循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可以成為下次循環(huán)的模板。 PCR的基本思路是基因擴增，可以使引物間的核酸片段擴增108以上，實驗成功至關(guān)重要的是合成引