第04講++基因克隆的載體與受體

1、用于核酸操作的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸外切酶核酸修飾酶第三講 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)單鏈DNA內(nèi)切酶基因工程原理綱要第一講 基因工程概論第二講 基因工程的主要技術(shù)第三講 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第四講 基因克隆的載體與受體第五講 目的基因的分離與克隆第六講 克隆基因的檢測(cè)與鑒定第七講 基因表達(dá)調(diào)節(jié)與產(chǎn)物純化第八講 從原核到真核基因工程質(zhì)粒載體噬菌體載體大分子DNA克隆載體基因打靶載體病毒載體第四講 基因克隆的載體與受體用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。1. 載體 (Vectors) （1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。 （2

2、）有選擇性標(biāo)記。（3）有一段多克隆位點(diǎn)。2. 基因工程對(duì)載體的要求外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制。（4）分子量小，拷貝數(shù)多。 （5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。 基因工程中常用的載體有5類： 3. 載體的種類質(zhì)粒（plasmid） 單鏈DNA噬菌體M13 噬菌體的衍生物 柯斯質(zhì)粒（cosmid） 動(dòng)物病毒（virus） 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（plasmid） 是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。大腸桿菌的質(zhì)粒（1）分子?。?1. 質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1200 kb（2）編碼基因少： 23個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。 （3）環(huán)形狀：雙鏈環(huán)

3、狀DNA。（酵母的“殺傷質(zhì)?！笔荝NA）。如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。（4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（super coil）Covalent close circular DNA 線形DNA （ linear ，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 開環(huán)DNA（ open circular， ocDNA）（5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。SCOCL二、質(zhì)粒的類型在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為： 接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能

4、自我轉(zhuǎn)移除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。1. 接合型質(zhì)粒：不符合基因工程的安全要求。大腸桿菌接合（conjunction）2. 非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。（1）R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。帶有控制大腸桿菌素（colicin）合成的基

5、因。（2）Col質(zhì)粒：大腸桿菌素對(duì)不帶Col質(zhì)粒的大腸桿菌有毒。Col質(zhì)?；騌質(zhì)粒如果帶有轉(zhuǎn)移基因，也可以成為接合型質(zhì)粒。三、質(zhì)粒的復(fù)制類型1. 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent plasmid）拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。2. 松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）拷貝數(shù)多，有1060份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。（1）分子量大，拷貝數(shù)低四、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1. 天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長 9.1 kb。但只有一個(gè)EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr 作為篩選標(biāo)志。ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿

6、菌素E1（colicin E1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicin E1的細(xì)胞.colicin E1能殺死不含ColE1 質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I 正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。ColE1（1） 具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）2. 質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。氨芐青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四環(huán)素抗性 （Tetr）

7、鏈霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）3. 質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理：（1）選擇標(biāo)記絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）青霉素的衍生物。通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的末端反應(yīng)，殺死生長的細(xì)菌。a）抑菌原理b）細(xì)菌抗性原理Ampr基因編碼-內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)。 ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）通過與50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ?。a）抑菌原理a）殺菌原理iii）卡那霉素（kanamy

8、cin，Kan）通過與70S核糖體結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生錯(cuò)讀。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理通過與30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。殺死細(xì)菌。b）細(xì)菌抗性原理Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結(jié)合作用。v）四環(huán)素（Tetracycline，Tet）b）細(xì)菌抗性原理a）抑菌原理通過于30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細(xì)菌。Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，阻止

9、四環(huán)素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)10003000個(gè)！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 但有特殊用途:由pSC101派生來的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí)會(huì)

10、嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴(kuò)增DNA用。（3）失控的質(zhì)粒載體這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于37 oC），拷貝數(shù)很少； 溫度增加（40 oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年B. E. Uhlin等構(gòu)建。（4） 插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性正選擇的質(zhì)粒載體如pUR2、pTR262等。只有帶有選

11、擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Direct selection vectors（6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號(hào)控制之下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。復(fù)制起始點(diǎn)ORI 選擇標(biāo)記 多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因 I 操縱基因O 啟動(dòng)基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)五、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1. pSC101第一個(gè)成功地用于克

12、隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長度9.09 kb（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr6個(gè)克隆位點(diǎn)： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個(gè)位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)2. ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多！ colicin

13、E1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因 殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因imm基因EcoR I位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）。EcoR I（4）克隆位點(diǎn)Colicin E1外源DNA無Colicin用對(duì)外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作選擇，操作非常繁雜。 對(duì)colicin E1敏感的細(xì)菌群體中自發(fā)突變產(chǎn)生抗colicin E1的頻率很高?。?）ColE1的選擇缺陷ColE1抗 c

14、olicinE1殺ColE1-仍抗 colicinE1不殺ColE1-插入片斷ColE1pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因3. pBR322（1）元件來源F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。 復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因 Tetr基因pSC101的Tetr 基因。（2）長度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn) 雙

15、抗菌素抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamH IAmp中存活但在Tet中死亡外源基因Pst ITet中存活但在Amp中死亡氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)10003000copy 安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù) 分子小，克隆能力大載體越小越好。 10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)。能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 刪除mob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pB

16、R327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。（7）PBR322的改進(jìn)pBR325：在pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也帶一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。 改造EcoR I 位點(diǎn)University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復(fù)制起點(diǎn)pBR32

17、2的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因（1）元件來源 lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌 lacZ基因大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列， 是LacZ 的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因（2）長度約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ基因的5端。Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（4）選擇標(biāo)記藍(lán)白斑選擇原理： X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）-半乳糖苷酶能把無色的化合物X-gal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)-半乳糖苷

18、酶 X-gal顯色反應(yīng)lacZ的肽互補(bǔ)1）-肽（ lacZ ）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體2）受體菌lacZ突變（lacZM15）受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X-gal 受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC質(zhì)粒載體上的lacZ 編碼肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“

19、互補(bǔ)”，使它能形成4聚體，從而能分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUC lacZ 受體菌lacZ3）載體lacZ與互補(bǔ)4）互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ的合成。不能互補(bǔ)。 lacZ 5 3 肽移碼突變lacZ 5 3 肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNAIPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ 的C端部分和載體的lacZ肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，仍然不能產(chǎn)生肽！IPTG通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有

20、DNA插入。MCS無插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。 MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：無質(zhì)粒的 受體菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解X-gal；無抗菌素抗性在含抗菌素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無 菌 斑生長質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物互補(bǔ)，能分解X-gal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有 藍(lán) 色菌 斑 生長帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)-半乳糖苷酶的缺失。不能分解X-gal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有 白 色菌 斑 生長 更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。 選擇方

21、便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。 測(cè)序方便pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測(cè)序。M13mp18的多克隆位點(diǎn)六、其它質(zhì)粒載體1. pGEM-3Z由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6。T7啟動(dòng)子SP6啟動(dòng)子MCSlacZ Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。 如果加入純化的T7或SP6 RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。 MCS與pUC18的完全一樣。2.

22、pGEM-4Z與pGEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換。pGEM-3Z的特點(diǎn)3. 穿梭質(zhì)粒載體（1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttle plasmid vectors）Yeast復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體（2）常用的穿梭質(zhì)粒載體（3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn) 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。 可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因。

23、克隆、構(gòu)建表達(dá)E.coliAnimal cell 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分 配到兩個(gè)子細(xì)胞中。有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說。（1）主動(dòng)分配天然質(zhì)粒。具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒。（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機(jī)分配但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。在寄主菌細(xì)胞分裂的過程中，有一個(gè)細(xì)胞沒有獲得質(zhì)?？截悾?/p>

24、最終繁殖成無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。3. 分離的不穩(wěn)定性（segregation instability）4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性（structural instability）寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。ISdimer重組（1）新陳代謝負(fù)荷：5. 影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長約15%。 復(fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。 轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（variance）：是產(chǎn)生無

25、質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。野生型E.coli中，質(zhì)粒在寄主的重組酶作用下會(huì)發(fā)生重組形成二聚體質(zhì)粒。（3）寄主菌的重組體系二聚體災(zāi)難（dimer catastrophe）：含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。二聚體質(zhì)粒的復(fù)制速度是單體的二倍！導(dǎo)致質(zhì)粒失控。第二節(jié) 噬菌體載體 噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。一、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。single linear DNA (about 182,000 bp)T2 Genomic DNA分為兩種：1

26、. 溶菌周期：二、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（virulent phage)2. 溶原周期：感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（temperate phage)原噬菌體（prophage)：三、單鏈?zhǔn)删w載體M13、f1、fd 噬菌體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13 噬菌體（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。1. 單鏈DN

27、A噬菌體的特點(diǎn)（3）RF DNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片 斷的單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。 但M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407 bp。（2）DNA長度（3）DNA提純（1）寄主M13序列（4）M13的生活周期雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長變慢，約為正常的1/23/4）M13通過雄性細(xì)菌的F性須注入其+DNA+DNA合成DNA，形成RF

28、 dsDNADNA轉(zhuǎn)錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細(xì)胞+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯+DNA指導(dǎo)合成+DNA200個(gè) RF DNA每個(gè)細(xì)胞可以放出約1000個(gè)M13顆粒！M13的包裝過程：RF dsDNA指導(dǎo)合成的+DNAM13基因V編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)移到寄主的細(xì)胞膜M13外殼蛋白基因V蛋白脫落+DNA溢出細(xì)胞膜包裝（5）沒有包裝限制3. M13載體的構(gòu)建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定 基因間隔區(qū)（int

29、ergenic region, IG區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) BsuI 切點(diǎn)。其余9個(gè)BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。 酶切位點(diǎn)M13J. Messing證明，IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。（2）加入酶切位點(diǎn) 在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn)第一個(gè)M13載體：M13mp1：M13 RFBsuI不完全消化各種長度的線性片斷（其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長M13）E.coli lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、

30、lacO、lacZ）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區(qū)插入lacZ才能存活并在X-gal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑（3）M13載體系列加上常用的酶切位點(diǎn)。 M13載體系列的命名M13mpn n代表系列數(shù)字 對(duì)M13mp1的改進(jìn)B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ 5端的第13個(gè)核苷酸G突變成A，產(chǎn)生了一個(gè)EcoR I切點(diǎn)。M13mp2：5ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亞硝基脲 把G甲基化 5ATGACCATGATTACGGATTCA-轉(zhuǎn)染E.coli。mG與T配對(duì)，復(fù)制兩次后 5ATGACCATGATTACGAATTCA-Ec

31、oRI切點(diǎn)用EcoRI切M13mp1M13mp2選擇能切開的 線性分子再環(huán)化M13mp1 對(duì)M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn)在M13mp2的LacZ的5端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對(duì)應(yīng)有相同MCS的pUC系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19成為M13mp系列載體：與與pUC18相同相同M13mp18的多克隆位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2） X-gal顯色反應(yīng)，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以

32、克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。MCS+-+-+-編碼鏈非編碼鏈外源DNA不同的酶切不同的酶切插入M13 vectorM13 RF+-+-+-外源DNA轉(zhuǎn)染E. coli成熟的子代M13中+ 插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 實(shí)際克隆能力小于1500bp。雖無包裝限制，并非無限包裝！5. M13載體的缺點(diǎn)由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。MCS噬菌體ori質(zhì)粒oriAmprlacZ lacI約3000bp（比M13小）克隆能力大能插入10kb的外源DNA。兩種復(fù)制形式分子量?。?）噬菌粒載體的特點(diǎn)既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬

33、菌體的復(fù)制起點(diǎn)。既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能在噬菌體內(nèi)進(jìn)行單鏈復(fù)制。（2）常見的噬菌粒載體噬菌粒載體質(zhì)粒部分單鏈?zhǔn)删w部分輔助噬菌體大腸桿菌寄主pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101 VXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/ pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL1-Blue輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。（3）pUC118/pUC119 構(gòu)成1）M13的基因間隔區(qū)（IG）2）pUC18/pUC19質(zhì)粒載體：帶有M13復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn) Ampr lacZ MCSMCSpUC18/

34、pUC19 oriAmprlacZ lacIM13 ori3.2kbpUC118/119 pUC118/119的復(fù)制模式兩種不同的復(fù)制模式1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式受pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)（來源于ColE1）的控制。每個(gè)細(xì)胞能達(dá)到500個(gè)拷貝。來源于M13的復(fù)制起點(diǎn)被輔助噬菌體的基因II產(chǎn)物控制。2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式外殼蛋白復(fù)制蛋白輔助M13包裝當(dāng)寄主細(xì)胞被輔助噬菌體M13感染后。 噬菌粒載體的包裝1）輔助噬菌體：自身的復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白，幫助噬菌粒載體復(fù)制。如M13K07等。2）包裝：輔助噬菌體外殼蛋白和 復(fù)制蛋白噬菌粒載體ssDNA噬菌體

35、（4）pBluescript 噬菌粒載體（pBS）Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7噬菌體的啟動(dòng)子組成。 特點(diǎn) 組成MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。1）定向體外轉(zhuǎn)錄2）兩種復(fù)制模式既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。3）選擇方便有Ampr和lacZ，可以進(jìn)行Amp抗性選擇和Xgal-IPTG藍(lán)白斑選擇。4）插入方便18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的MCSSK：表示lacZ的轉(zhuǎn)錄方向是沿MCS上的 SacI KpnI +（f1+）：單鏈復(fù)制起始方向背離 lacZ，能回收la

36、cZ的編碼鏈（+）pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）KS：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）-（f1-）：能回收lacZ的非編碼鏈（-）1）pBluescript SK/KS（+/-）區(qū)分： 常用的 pBluescript 載體pBS SK+pBS KS-（5）PCR產(chǎn)物克隆載體 T 載體pCR系列載體Invitrogen公司開發(fā)的線性噬菌粒載體。 結(jié)構(gòu)pUC的質(zhì)粒部分、f1噬菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個(gè)3端突出的T。 特點(diǎn)PCR產(chǎn)物往往在3端突出一個(gè)A，所以能與這個(gè)載體直接連接。克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)

37、的EcoRI切下來回收。pGEM-T vectorG418抗性可在真核生物表達(dá)外顯子捕捉AATTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAAPhage display vector）（1）噬菌體展示（Phage display）將外源蛋白（多肽、酶、抗體、DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合到噬菌體的外殼蛋白上形成融合蛋白，表達(dá)于噬菌體的外表面。G. P. Smith1985年發(fā)明。絲狀噬菌體（M13、f1等）外殼顆粒的一端，有3-5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)（g3p），在識(shí)別和吸附大腸桿菌的過程中起作用。M13（2）噬菌體展示載體的構(gòu)建把外源DNA片斷插入基因的序列前端，并保持兩者的閱讀框正

38、確，表達(dá)出融合蛋白。啟動(dòng)子外源DNAM13基因oriM13 display vector外源多肽四、雙鏈?zhǔn)删w載體載體（1）長度為48502 bp； （2）雙鏈線性DNA； （3）但在兩端有cos位點(diǎn)，可以環(huán)化。DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。1. DNA分子的特點(diǎn) cos位點(diǎn)（cohensive-end site）：DNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF DNA）。噬菌體和其DNADNA上有至少61個(gè)基因，有一半是必須的，與自身的活動(dòng)有關(guān)，成簇排列。 其他約1/3是非必須基因（位于尾部合成至阻遏之間的區(qū)段）。2. 噬菌體的基因組特點(diǎn) 噬

39、菌體感染細(xì)菌的早期：雙鏈進(jìn)行型復(fù)制。3. DNA的復(fù)制模型（1） 型復(fù)制（2）滾環(huán)復(fù)制 感染的晚期：啟動(dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。形成多聯(lián)體 DNA分子。這種多聯(lián)體分子必須在cos位點(diǎn)被切斷成單體分子才能被包裝起來。（1）構(gòu)建原理：4. 噬菌體載體的構(gòu)建（2）構(gòu)建過程在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn) 引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記 突變某些基因，使它成為安全載體 刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn)噬菌體DNA上本身有5個(gè) EcoR I 和7 個(gè)Hind III切點(diǎn)！刪除噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。（3）人工構(gòu)建的噬菌體載體有兩種類型： 插入型載體（insertion vectors)：如 gt10、g

40、t11、BV2、NM540、NM1590、NM6071）免疫功能失活型：插入位點(diǎn)位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi)。EcoR IcIgt10插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物，載體DNA不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 沒有外源DNA插入的載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。選擇標(biāo)記:如NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因內(nèi)部。2）-半乳糖苷酶失活型載體：在基因組中引入了LacZ序列。（其上含有一個(gè)EcoR I 克隆位點(diǎn)）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利用X-gal的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記。LacZ EcoR ICharon

41、16A選擇標(biāo)記: 替換型載體（substitution vectors) 兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于DNA的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換?？芍脫Q區(qū)MCSMCS如： EMBL4、Charon40等。1） EMBL4 EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有Sal I酶切位點(diǎn)。以便于進(jìn)一步消化中間片斷，防止自我連接。左臂可置換區(qū)右臂EcoR I BamH I Sal ISal I BamH I EcoR ISal I Sal IEMBL42）Charon40Charon40的可置換片斷是由DNA短片重復(fù)構(gòu)成，片斷之間有Hae I 切點(diǎn)。在克隆

42、的時(shí)候，可以用Hae I 酶進(jìn)一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。左臂可置換區(qū)右臂MCSMCSCharon40Hae I可取代片斷中如果包含LacZ，可用Xgal顯色作篩選標(biāo)記。（4）載體的篩選標(biāo)記 插入型載體根據(jù)插入所引起的表型突變。 置換型載體載體克隆策略置換型載體 DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí)效率遠(yuǎn)比質(zhì)粒低。5. 載體的體外包裝 在試管中與噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中。必須利用噬菌體外殼的作用！（1）體外包裝： 的D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 DNA 進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。（2）體外包

43、裝過程 噬菌體外殼蛋白的合成E 基因的E 基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因E基因突變只合成尾部蛋白和包裝識(shí)別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的載體DNA體外包裝成活性噬菌體外源的重組DNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原DNA發(fā)生重組。（3）體外包裝存在的問題： 包裝錯(cuò)誤：既能包裝用于生產(chǎn)頭部蛋白的內(nèi)源性原DNA，也能包裝重組的DNA載體。 重組： 體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%105% （3651kb）之間。既不能超過正常野生型容量的5%； 又不能低于正常野生型容量的75%野生型DNA的必須區(qū)是28

44、kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。（實(shí)際上為15kb）。比一般的質(zhì)粒載體的容量大的多。 （4）DNA載體的優(yōu)點(diǎn)用在真核生物基因組文庫的建立。Sau3ABamHI噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑1978年J. Collins和B. Hohn等人發(fā)展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid) DNA：46kb（1）大小 （2）組成 cos序列和控制包裝的的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子 抗藥性基因 幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)噬菌體DNA的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成。具有噬菌體的特性：（3）cosmid vector的特點(diǎn) 克隆外源DNA后可以體外包裝

45、成噬菌體顆粒。在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌 ）。具有質(zhì)粒載體的特性：大多帶有pMB1或ColE1的復(fù)制子，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。方便的選擇：高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb（4）部分cosmid vectorCosmid 載體復(fù)制子大?。╧b)選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)克隆能力（kb)c2XBpMB16.8Ampr, Kanr BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaI3245pHC79pMB16.4Ampr , Tetr EcoRI, HindIII,

46、SalI, BamHI, PstI, CalI2946pHS262ColE12.8Kanr BamHI, EcoRI, HincII3450pJC74ColE115.8Ampr EcoRI, BamHI, BglII, SalI2137pJC75-58ColE111.4AmprEcoRI, BamHI, BglII1642pJC74mColE121Ampr, KanrBamHI1632pJC720ColE17.1Elimm, Rifr HindIII, XmaI1128Cosmid 載體復(fù)制子大小（kb)選擇標(biāo)記克隆位點(diǎn)克隆能力（kb)pJC81pMB17.1Ampr, TetrKpnI,Ba

47、mHI,HindIII,SalI3046pJB8ColE1 5.4Ampr BamHI,HindIII,SalI3147MuA-3pMB14.8TetrPstI,EcoRI,BalI,PvuI, PvuII3248MuA-10pMB14.8TetrEcoRI,BalI,PvuI,PvuI3248pTL5pMB15.6TetrBglII,BalI,HpaI3147pMF7pMB1 5.4Ampr EcoRI,SalI3248應(yīng)用cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組DNA技術(shù)，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。（5）cosmid cloning 理論依據(jù)：cos位點(diǎn):噬

48、菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)DNA通過cos位點(diǎn)連接的“多聯(lián)體”分子。“多聯(lián)體”復(fù)制：包裝識(shí)別。在包裝的時(shí)候， 噬菌體具有位點(diǎn)特異的末端酶（terminase）體系（Ter體系），識(shí)別cos位點(diǎn)，把多聯(lián)體切成單個(gè)DNA長度。兩個(gè)cos位點(diǎn)之間，必須保持3845kb的DNA，Ter體系才能識(shí)別。Ter體系：包裝限制：用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物DNA。（6）cosmid克隆的一般過程用同樣的內(nèi)切酶消化cosmid載體。產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個(gè)cos位點(diǎn)、長度40kb左右的真核DNA與載體的連接物。連接切割合適長度的雜種DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種DNA

49、分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制。感染大腸桿菌 Ter體系識(shí)別并切割大質(zhì)粒！載體片斷自我連接。外源DNA片斷自我連接。多個(gè)本來不在一起的外源DNA片斷連接起來同時(shí)插入載體。（7）cosmid載體克隆的缺點(diǎn)用堿性磷酸酶除去線性質(zhì)粒片斷5端的磷酸，可防止載體自體連接?？朔d體自體連接的改良方案： Ish-HorowiceBurke改良方案1981年，D. Ish-Horowice和J.F. Burke 。（8）cosmid載體的改良在BamH I位點(diǎn)兩側(cè)各有一個(gè)EcoR I切點(diǎn)。1）突出的特點(diǎn)：pJB8 cosmid載體使克隆在BamH I上的外源DNA可被EcoR I切下來。包裝識(shí)別包裝識(shí)別2）Is

50、h-HorowiceBurke方案克隆過程HindIIISalISalIHindIIIBamHI1983年P(guān).F. Bates和R.A. Swift Bates-Swift 改良方案a. 具有兩個(gè)cos位點(diǎn)。SmaI平端的連接效率低，阻止了載體臂的自我連接，增加了外源DNA的連接效率。1）特點(diǎn)：b. 一個(gè)SmaI切點(diǎn)把兩個(gè)cos位點(diǎn)分開。c. BamHI克隆位點(diǎn)。c2XB cosmid載體Bates-Swift 克隆過程：第三節(jié) 大分子DNA克隆載體A.W.Murray 1983年形成基礎(chǔ)理論, D.T.Burke等1987年變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。一、酵母人工染色體1. YAC的特點(diǎn)：（1）只能在酵母細(xì)胞

51、中擴(kuò)增。（yeast artificial chromosome, YAC)（2）克隆容量大，為230kb-1700kb。（3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。（1）DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ori） 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：TELTELCENORI（2）著絲粒（centromere，cen）（3）兩個(gè)端粒（telomeres，tel）LeuARSCENLeu- Yeast后代死Leu- Yeast80%后代死Leu- Yeast后代活Leu- Yeast后代死Leu- Yeast后代活TelTel（1）著絲粒區(qū)（CEN）A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA3. YA

52、C的組成結(jié)構(gòu)酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列:78-86bpIIIIII由三個(gè)區(qū)組成酵母第3、4、6、11號(hào)染色體的著絲粒區(qū)序列：酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重復(fù)序列。（3）復(fù)制起點(diǎn)（ORI）約100bp的自主復(fù)制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）人是TTAGGG重復(fù)序列; 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列。（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個(gè)端粒序列Tel。位于 SUP4 基因內(nèi)部。（4）克隆位點(diǎn)插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色； 不失活的菌落是白色。TRP1、URA3（分別位于兩臂）。細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori和抗生素標(biāo)記Ampr （5）在酵母中的標(biāo)記基因（6）在細(xì)菌中操作URA

53、3TRP1 CEN44. YAC克隆外源DNA（1）宿主酵母菌： 只有同時(shí)得到Y(jié)AC的兩個(gè)臂，才能在基本培養(yǎng)基（不加TRP和URA）上生長。（2）選擇方式5. YAC轉(zhuǎn)化過程trp- 和 ura-cenura3trp1（1）存在插入子的穩(wěn)定性問題。6. YAC的缺點(diǎn)：（2）同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個(gè)YAC引起交換。（3）轉(zhuǎn)化效率低。（4）難以制備純的YAC-DNA。結(jié)合組蛋白H. Shizuya等1992年在大腸桿菌F因子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。（2）克隆容量可達(dá)300kb。二、細(xì)菌人工染色體（BAC）1. F質(zhì)粒的特點(diǎn)：每細(xì)胞只有一個(gè)拷貝，不會(huì)重組。（4）便于提純像提取質(zhì)粒一樣直接提純。（1）單拷貝復(fù)制。（

54、3）比較穩(wěn)定。（1）OriS和repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制。 （2）parA和parB維持低水平質(zhì)粒拷貝數(shù)。2. BAC的組成結(jié)構(gòu)（3）CosN是噬菌體末端酶專一性切割位點(diǎn)。 （4）loxP是P1 Cre蛋白作用位點(diǎn)。 （5）HindIII和BamHI是插入位點(diǎn)。 （6）兩側(cè)的NotI可用于切下外源DNA。（7）氯霉素抗性基因CMR 一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體1.反轉(zhuǎn)錄病毒（ritrovirus）屬于正鏈RNA病毒，顯著的特點(diǎn)是具有2倍體基因組。 兩個(gè)相同的RNA分子在5端附近經(jīng)氫鍵連接形成70S RNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)節(jié)作用。反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)Influenza virusHIV類似于真核

55、細(xì)胞mRNA2. 反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)envpolgagU3U3U5U5cappolyA3 5 LTRLTRRR+Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV)長末端重復(fù)序列。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。整合時(shí)，整合酶在U5-U3連接處切開雙鏈DNA，隨機(jī)插入到宿主基因組里。 LTR本身還具有啟動(dòng)子和polyA加尾信號(hào)的功能。LTR：+：組裝時(shí)必需的非編碼序列。 env：外殼蛋白。 pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。 gag：核心蛋白。envpolgagU3U3U5U5cappolyA3 5 LTRLTRRR+U5、U3：5段或3端獨(dú)特序列。（1）刪除pol、

56、env和gag基因。 5LTR +外源基因neor3LTR啟動(dòng)子（2）插入標(biāo)記基因（如neor）。（3）外源基因和啟動(dòng)子插入到+下游。反轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的效率很低，必須包裝成病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用兩個(gè)缺失了+的反轉(zhuǎn)錄病毒染色體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以制造病毒外殼蛋白。 （1）包裝細(xì)胞系的構(gòu)建5LTRgag3LTRpolenv3LTR5LTR5LTRgag3LTRpolenv3LTR5LTR病毒外殼蛋白包裝細(xì)胞（2）載體RNA的包裝用載體DNA轉(zhuǎn)化包裝細(xì)胞系轉(zhuǎn)入的載體DNA上帶有+，轉(zhuǎn)錄成的載體RNA就會(huì)被包裝細(xì)胞中原有的病毒外殼蛋白識(shí)別包裝成重組病毒顆粒。 5LTR +外源基因neor3LTR高效轉(zhuǎn)染

57、靶細(xì)胞（1）將DNA插入宿主基因組的隨機(jī)位點(diǎn)上。 （2）侵染范圍廣、感染率高。 （3）整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定， 拷貝數(shù)目較低。 （4）包裝的外源DNA可達(dá)10kb。 （5）反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，對(duì)宿主 細(xì)胞沒有毒性。反轉(zhuǎn)錄病毒一般只感染處在分裂狀態(tài)的細(xì)胞。二、DNA病毒載體腺病毒（adenovirus）1. 腺病毒的基因組線狀雙鏈DNA病毒，基因組中有14個(gè)基因。 共同特點(diǎn)是都帶有倒置的末端重復(fù)（ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。（1）比較安全，無致病、致癌、致畸作用。 （2）宿主范圍廣2. 優(yōu)點(diǎn)不僅能感染有分裂能力的細(xì)胞，也能感染不能分裂的細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）。（4

58、）載體中的插入片斷可達(dá)7.5kb （有包裝容量限制）。 （5）腺病毒容易制備、純化。 （6）基因組結(jié)構(gòu)和功能了解得清楚。（3）可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式感染。是目前最常用的基因治療載體之一。（1）腺病毒載體的構(gòu)建用同源重組的方法插入外源基因。刪除腺病毒DNA一些非必需區(qū)ITR E1ITRE3如E1或E3區(qū)，增加插入能力。E1或E3缺失病毒。含有E1或E3區(qū)兩側(cè)的同源序列。在同源序列之間插入外源基因和選擇標(biāo)記基因。構(gòu)建質(zhì)粒載體把質(zhì)粒切成線性共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞在細(xì)胞中發(fā)生同源重組，把外源DNA加到病毒基因組中，并包裝成重組病毒顆粒。質(zhì)粒與病毒DNA（缺失E1或E3）（1）以游離的附加體形式存在于細(xì)胞中 不能整合