克隆載體表達(dá)載體(課件)

1、LOGO克隆載體克隆載體 表達(dá)載體表達(dá)載體 定義：定義：可攜帶插入的外源外源DNA片段片段并可轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增大量擴(kuò)增的DNA分子。該分子中含有能夠在受體細(xì)胞中自主復(fù)制的序列和自主復(fù)制的序列和篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記，常用于外源基因的克隆，如噬菌體或質(zhì)粒。 通常采用從病毒、質(zhì)?；蚋叩壬锛?xì)胞中獲取的DNA作為克隆載體，在載體上插入合適大小的外源DNA片段，并注意不能破壞載體注意不能破壞載體的自我復(fù)制性質(zhì)的自我復(fù)制性質(zhì)。將重組后的載體引入到宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中大量繁殖?？寺≥d體克隆載體克隆載體必須具備什么條件克隆載體必須具備什么條件?具有使外源具有使外源DNA片段插入片段插入的限制性酶識的限

2、制性酶識別位點（外源別位點（外源性性DNA能組入）能組入）能將外源能將外源DNA導(dǎo)入到受體細(xì)導(dǎo)入到受體細(xì)胞并進(jìn)行自我胞并進(jìn)行自我復(fù)制（能繁殖）復(fù)制（能繁殖）必須具有選擇必須具有選擇標(biāo)記（能篩選標(biāo)記（能篩選出來）出來）A C B 常用的克隆載體常用的克隆載體 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 病毒載體病毒載體( (噬菌體載體噬菌體載體) )混合載體（由以上三類中的兩種以上相混合載體（由以上三類中的兩種以上相互組合或與其他基因組互組合或與其他基因組DNADNA組合而成）組合而成）拷貝數(shù)不能太低，以保證轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該有兩個以上用來克隆外源DNA的單一的限制性內(nèi)切酶識別位點；應(yīng)該有一個或多個易于檢出的選擇標(biāo)記基因123

3、專用載體專用載體 染色體定位整合載體染色體定位整合載體 啟動子探針載體啟動子探針載體 誘導(dǎo)型表達(dá)載體誘導(dǎo)型表達(dá)載體 組織特異性表達(dá)載體組織特異性表達(dá)載體 反義表達(dá)載體反義表達(dá)載體 v 定義：定義：在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件增加表達(dá)元件（如啟動子、RBS、終止子等），使目的基因能夠表達(dá)目的基因能夠表達(dá)的載體。v 包括原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒、噬菌體或病毒等。典型的表達(dá)載體帶有能使基因表達(dá)的調(diào)控序列調(diào)控序列，并在適當(dāng)位置有可插入外源基因的限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶位點切酶位點。表達(dá)載體表達(dá)載體LOGO常用細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建，構(gòu)建過程中運(yùn)常用細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建

4、，構(gòu)建過程中運(yùn)用限制性核酸內(nèi)切酶切割出與目的基因用限制性核酸內(nèi)切酶切割出與目的基因相合的末端（多為黏性末端，也有平末相合的末端（多為黏性末端，也有平末端），采用端），采用DNA連接酶連接，導(dǎo)入生物連接酶連接，導(dǎo)入生物體實現(xiàn)表達(dá)。標(biāo)記基因可幫助識別質(zhì)粒體實現(xiàn)表達(dá)。標(biāo)記基因可幫助識別質(zhì)粒并檢測是否成功整合到染色體并檢測是否成功整合到染色體DNA中。中。 表達(dá)載體四部分：目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因 表達(dá)載體必須具備的條件：表達(dá)載體必須具備的條件： 1.載體能夠獨立的復(fù)制； 2.應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選； 3.應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能被RNA聚合酶所識別； 4.應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄； 5.應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆