植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

1、編輯課件1提高植物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝提高植物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法產(chǎn)物產(chǎn)量的方法編輯課件2初生代謝初生代謝(primary metabolism)是指能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成細(xì)是指能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、維持細(xì)胞正常的生命活動(dòng)或能量的代謝，初胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、維持細(xì)胞正常的生命活動(dòng)或能量的代謝，初生代謝的產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物生代謝的產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物(primary metabolites)，如糖、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸等。它們是維持細(xì)胞生命活動(dòng)如糖、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸等。它們是維持細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的。所必需的。次生代謝產(chǎn)物次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites)是指植

2、物體內(nèi)的一大是指植物體內(nèi)的一大類(lèi)細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育正常運(yùn)行非必需的小分子類(lèi)細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育正常運(yùn)行非必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常具有種屬、器官、組織和有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常具有種屬、器官、組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性，次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性，次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代謝程稱為次生代謝(secondary metabolism) 。 前言前言編輯課件3編輯課件41.1.外植體選擇外植體選擇2.2.高產(chǎn)細(xì)胞系選擇高產(chǎn)細(xì)胞系選擇3.3.物理因素：光照、物理因素：光照、pHpH、通氣、接種量、通氣、接種量4.4.化學(xué)因素：培養(yǎng)基

3、種類(lèi)及激素化學(xué)因素：培養(yǎng)基種類(lèi)及激素 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑 前提物質(zhì)添加前提物質(zhì)添加 抑制劑添加抑制劑添加 提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法編輯課件51. 1. 外植體選擇外植體選擇l首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物的植物種類(lèi)。首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物的植物種類(lèi)。l起始培養(yǎng)材料還應(yīng)考慮器官和組織特異性，通常選取自起始培養(yǎng)材料還應(yīng)考慮器官和組織特異性，通常選取自然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物部位的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞經(jīng)然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物部位的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后常常具有合成目的產(chǎn)物的能力，或比較容易過(guò)培養(yǎng)以后常常具有合成

4、目的產(chǎn)物的能力，或比較容易誘導(dǎo)合成目的產(chǎn)物。誘導(dǎo)合成目的產(chǎn)物。東北紅豆杉幼嫩莖、葉片以及芽三種外植體的愈傷組東北紅豆杉幼嫩莖、葉片以及芽三種外植體的愈傷組織中紫杉醇含量比較顯示，以織中紫杉醇含量比較顯示，以葉片葉片為外植體的愈傷組為外植體的愈傷組織，其紫杉醇含量是其它兩種外植體形成的愈傷組織織，其紫杉醇含量是其它兩種外植體形成的愈傷組織的的3 3倍。倍。在茜草（在茜草（Rubia cordifoliaRubia cordifolia）愈傷組織培養(yǎng)中，來(lái)源愈傷組織培養(yǎng)中，來(lái)源于于葉柄和莖葉柄和莖的愈傷組織蒽醌的積累量比來(lái)源于莖尖和的愈傷組織蒽醌的積累量比來(lái)源于莖尖和葉的愈傷組織高。葉的愈傷組織高

5、。 編輯課件6 解決植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物含量低的最有效的手段之一是解決植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物含量低的最有效的手段之一是篩選高產(chǎn)細(xì)胞株。用來(lái)篩選的細(xì)胞來(lái)源可以是有足夠生理和形態(tài)篩選高產(chǎn)細(xì)胞株。用來(lái)篩選的細(xì)胞來(lái)源可以是有足夠生理和形態(tài)異質(zhì)性的細(xì)胞群，也可以是通過(guò)物理或化學(xué)因子誘變處理產(chǎn)生的異質(zhì)性的細(xì)胞群，也可以是通過(guò)物理或化學(xué)因子誘變處理產(chǎn)生的突變體群。突變體群。 篩選方法篩選方法: :目測(cè)法目測(cè)法, ,放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、流動(dòng)細(xì)胞測(cè)定法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、流動(dòng)細(xì)胞測(cè)定法、瓊脂小塊法等。瓊脂小塊法等。2. 2. 高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選 編輯課件7光照：光照：對(duì)次生代謝

6、產(chǎn)物的合成有重要影響對(duì)次生代謝產(chǎn)物的合成有重要影響. . 不同植物細(xì)胞不同植物細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí), , 對(duì)光質(zhì)和光量的要求是不同的對(duì)光質(zhì)和光量的要求是不同的, , 如玫瑰茄懸浮細(xì)胞合成花青素時(shí)如玫瑰茄懸浮細(xì)胞合成花青素時(shí), , 藍(lán)光是促進(jìn)玫瑰茄細(xì)藍(lán)光是促進(jìn)玫瑰茄細(xì)胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光, , 產(chǎn)量為產(chǎn)量為416 mg/ L, 416 mg/ L, 和全和全色光差不多色光差不多, , 紅光和橙光無(wú)效紅光和橙光無(wú)效, , 其他單色光隨其波長(zhǎng)接其他單色光隨其波長(zhǎng)接近藍(lán)光近藍(lán)光, , 正效應(yīng)增強(qiáng)。正效應(yīng)增強(qiáng)。pHpH值：值：植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜植物細(xì)

7、胞培養(yǎng)的最適宜pH pH 值在值在5-6 5-6 之間之間, ,但也存在但也存在差異。研究表明差異。研究表明, ,南方紅豆杉南方紅豆杉( ( Tax us chinensis ) ) 的愈傷的愈傷組織生長(zhǎng)及紫杉醇的含量受組織生長(zhǎng)及紫杉醇的含量受pH pH 值的影響較大值的影響較大,pH 5.5 ,pH 5.5 對(duì)對(duì)愈傷組織生最為有利愈傷組織生最為有利, ,達(dá)接種量的達(dá)接種量的3.84 3.84 倍倍, ,但紫杉醇的含但紫杉醇的含量較量較 低低,pH 7.0 ,pH 7.0 時(shí)時(shí), ,愈傷組織的生長(zhǎng)量?jī)H為接種量愈傷組織的生長(zhǎng)量?jī)H為接種量2.802.80倍倍, ,而紫杉醇含量卻達(dá)而紫杉醇含量卻達(dá)p

8、H 5.5 pH 5.5 時(shí)的時(shí)的2 2 倍多。倍多。3. 物理因素物理因素 編輯課件8溫度：溫度：不同種類(lèi)的植物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度的要求是不同的不同種類(lèi)的植物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度的要求是不同的, , 最最適的溫度為適的溫度為25 25 左右左右, , 超過(guò)超過(guò)30 , 30 , 對(duì)生長(zhǎng)有明顯的抑制對(duì)生長(zhǎng)有明顯的抑制作用作用. . 較低的溫度有利于生物堿的合成較低的溫度有利于生物堿的合成, , 而高溫則會(huì)導(dǎo)致而高溫則會(huì)導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止。次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止。通氣狀況：通氣狀況：國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn): : 利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)長(zhǎng)春花利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)長(zhǎng)春花細(xì)胞生產(chǎn)阿瑪堿時(shí)細(xì)胞

9、生產(chǎn)阿瑪堿時(shí), , 溶解氧在溶解氧在29%-43% 29%-43% 時(shí)時(shí), ,溶解氧與阿瑪堿溶解氧與阿瑪堿的產(chǎn)量顯著相關(guān)。的產(chǎn)量顯著相關(guān)。接種量：接種量：接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累, , 接種時(shí)必須接種時(shí)必須滿足一定的接種量。滿足一定的接種量。編輯課件94. 化學(xué)因素化學(xué)因素4.1 培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分l 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量 增長(zhǎng)，另一方面要使細(xì)胞能合成和積累次生產(chǎn)物。增長(zhǎng)，另一方面要使細(xì)胞能合成和積累次生產(chǎn)物。l 一般來(lái)說(shuō)，增加培養(yǎng)基的一般來(lái)說(shuō)，增加培養(yǎng)基的N N、P P和和K K

10、的濃度能促進(jìn)細(xì)胞生的濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成。長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成。l 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)、濃度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和次生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)、濃度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和次生 產(chǎn)物的合成起著重要的作用。產(chǎn)物的合成起著重要的作用。紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加一定濃度的紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加一定濃度的2,4-D2,4-D，可以顯著提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率，增加細(xì)胞生物量，添加可以顯著提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率，增加細(xì)胞生物量，添加適當(dāng)濃度的適當(dāng)濃度的BABA和和KTKT，則可提高紫杉醇的積累。，則可提高紫杉醇的積累。編輯課件104.2 添加誘導(dǎo)子添加誘導(dǎo)子l誘

11、導(dǎo)子誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中一個(gè)反應(yīng)，并形成細(xì)胞，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中一個(gè)反應(yīng)，并形成細(xì)胞特征性自身防御反應(yīng)的分子。特征性自身防御反應(yīng)的分子。l目前使用的激發(fā)子可分為兩類(lèi)：目前使用的激發(fā)子可分為兩類(lèi)：非生物誘導(dǎo)子非生物誘導(dǎo)子（abiotic elicitorabiotic elicitor） 輻射、金屬離子輻射、金屬離子等。等。生物誘導(dǎo)子生物誘導(dǎo)子（biotic elicitorbiotic elicitor） 生物激發(fā)子根據(jù)其來(lái)生物激發(fā)子根據(jù)其來(lái)源不同又可分為外源性誘導(dǎo)子（源不同又可分為外源性誘導(dǎo)子（exogenous elicitorexogenous elicitor）和內(nèi)源性誘

12、導(dǎo)子（和內(nèi)源性誘導(dǎo)子（endogenous elicitorendogenous elicitor）。）。外源性激發(fā)外源性激發(fā)子多來(lái)源于微生物，包括經(jīng)處理的有機(jī)體如菌絲，或微子多來(lái)源于微生物，包括經(jīng)處理的有機(jī)體如菌絲，或微生物機(jī)體浸提物以及由微生物產(chǎn)生的多糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)生物機(jī)體浸提物以及由微生物產(chǎn)生的多糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)以及脂肪酸類(lèi)等。內(nèi)源激發(fā)子是來(lái)源于植物結(jié)構(gòu)的化合以及脂肪酸類(lèi)等。內(nèi)源激發(fā)子是來(lái)源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細(xì)胞壁的酶類(lèi)、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖以及其物。如降解細(xì)胞壁的酶類(lèi)、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖以及其它有機(jī)分子。它有機(jī)分子。 編輯課件11l 誘導(dǎo)子能增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸作用誘導(dǎo)子能增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸

13、作用, , 提供產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的提供產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的 能量能量, , 使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, , 利于代謝物的形成、運(yùn)輸和積累。利于代謝物的形成、運(yùn)輸和積累。l 目前應(yīng)用最廣、研究最多的是目前應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌誘導(dǎo)子真菌誘導(dǎo)子, , 如張長(zhǎng)平等在如張長(zhǎng)平等在紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中加入真菌誘導(dǎo)子紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中加入真菌誘導(dǎo)子, , 結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), , 紫杉紫杉醇的合成被加強(qiáng)醇的合成被加強(qiáng), , 產(chǎn)量得到了顯著提高。產(chǎn)量得到了顯著提高。l 除真菌誘導(dǎo)子外除真菌誘導(dǎo)子外, , 目前在提高植物次生代謝產(chǎn)物方面研究目前在提高植物次生代謝產(chǎn)物方面研究得較多的還包括

14、得較多的還包括寡糖素、茉莉酸類(lèi)、金屬離子和紫外光寡糖素、茉莉酸類(lèi)、金屬離子和紫外光等等. .金金屬離子作為誘導(dǎo)子主要有屬離子作為誘導(dǎo)子主要有CuCu2+ 2+ 、CaCa2+ 2+ 、MgMg2+2+等。等。l 孫彬賢等以南方紅豆杉懸浮細(xì)胞為材料孫彬賢等以南方紅豆杉懸浮細(xì)胞為材料, , 在懸浮細(xì)胞中加在懸浮細(xì)胞中加入茉莉酸甲酯入茉莉酸甲酯, , 紫杉醇含量提高了紫杉醇含量提高了1010倍。倍。 編輯課件124.3 前體飼喂前體飼喂n 前體指處于目標(biāo)代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì)。上游化合前體指處于目標(biāo)代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì)。上游化合物作為酶的底物，其濃度高低決定了催化反應(yīng)速度的大小物作為酶的底

15、物，其濃度高低決定了催化反應(yīng)速度的大小，濃度高則反應(yīng)速度大。加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙，濃度高則反應(yīng)速度大。加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，利于次生代謝物或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，利于次生代謝物的生產(chǎn)。的生產(chǎn)。 向銀杏培養(yǎng)基中添加異戊二烯等前體物質(zhì)向銀杏培養(yǎng)基中添加異戊二烯等前體物質(zhì), , 有效地提高了有效地提高了銀杏內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯B B 的產(chǎn)量的產(chǎn)量. . 向東北紅豆杉懸浮細(xì)胞體系中加入前體物苯丙氨酸和醋酸向東北紅豆杉懸浮細(xì)胞體系中加入前體物苯丙氨酸和醋酸鈉，可顯著提高紫杉醇含量且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)鈉，可顯著提高紫杉醇含量且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi), , 隨前體物濃隨前體物濃度的增加促進(jìn)作用加強(qiáng)度的增加促進(jìn)作用加強(qiáng). . n 添加的前體物種類(lèi)、濃度和時(shí)間對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響在添加的前體物種類(lèi)、濃度和時(shí)間對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響在很多細(xì)胞培養(yǎng)中也得到體現(xiàn)。很多細(xì)胞培養(yǎng)中也得到體現(xiàn)。編輯課件13