病毒膜蛋白及其表達(dá)和純化技術(shù)的研究進(jìn)展_cropped

1、海 洋 湖 沼 通 報(bào)Transactions of Oceanology and Limnology2002 年4文章編號(hào)：10036482（2002）04007607病毒膜蛋白及其表達(dá)和純化技術(shù)的研究進(jìn)展*解飛霞 1宋曉玲 2倢 2黃(1 青島海洋大學(xué)， 266003)(2 中國水產(chǎn)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071)摘 要：病毒囊膜是包膜病毒除核衣殼外的另一主要成分。它主要由多種蛋白質(zhì)構(gòu)成，稱為膜蛋白。膜蛋白以單聚體、二聚體、三聚體，甚至更多的聚合體的形 式存在，具有中和抗體、與靶細(xì)胞受體結(jié)合、凝集紅細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞融合等多種功 能。膜蛋白可采用將其基因整合入載體，并在昆蟲細(xì)胞、哺乳

2、細(xì)胞或細(xì)菌中獲得體 外表達(dá)。膜蛋白可在去污劑的作用下形成蛋白質(zhì)-脂-去污劑的復(fù)合物而被溶解，其 中去污劑的臨界微團(tuán)濃度、親水物-親脂物平衡值、荷電、紫外穿透性等是選擇合適 去污劑的主要參考因子。溶解后的膜蛋白多利用聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠過濾層 析、離子交換層析、親和層析、高效液相層析等技術(shù)并結(jié)合梯度離心、分級(jí)沉淀等 進(jìn)行分離、純化。關(guān)鍵詞：病毒膜蛋白，結(jié)構(gòu)，功能，表達(dá)，純化中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A病毒是由一個(gè)或幾個(gè) RNA 或 DNA 分子組成的傳染因子。通常有一種或幾種蛋白構(gòu)成的衣殼包圍。比較復(fù)雜的病毒在核衣殼外面還有一層或幾層富含脂質(zhì)的外膜，即囊膜。例如, 單 純皰疹病毒 HSV、冠性

3、病毒 coronavirus、腺病毒 adenovirus、蟲媒病毒 alphavirus、黃病毒flavivirus、風(fēng)疹病毒 rubellavirus、昆蟲病毒 pestivirus 等等。包膜的成分主要來自其宿主細(xì) 胞，由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖類等組成。蛋白質(zhì)是病毒粒子除核酸以外的又一主要成分。膜蛋白大多是由核衣殼在感染細(xì)胞內(nèi)穿越核膜得到的或在感染細(xì)胞表面“出芽”時(shí)由細(xì)胞獲得， 但囊膜也含有特異的病毒蛋白單位。中和抗體、與靶細(xì)胞結(jié)合、紅細(xì)胞凝集等是病毒膜蛋白的主要功能。純化膜蛋白并對(duì)其進(jìn)行研究，對(duì)研究病毒感染的分子機(jī)理，進(jìn)一步對(duì)阻斷病毒 與靶細(xì)胞結(jié)合及生產(chǎn)新型疫苗有著重要的意義。1病毒膜蛋白

4、的結(jié)構(gòu)與功能1 . 1 病毒膜蛋白的結(jié)構(gòu)病毒完成裝配后，從細(xì)胞中釋放出來。細(xì)胞膜雙層磷脂中原有的細(xì)胞源性蛋白被病毒第一作者簡介：解飛霞，女，1976 年生。青島海洋大學(xué)生命學(xué)院海洋生物系碩士研究生。收稿日期：2001-12-30.徐懷恕 1蛋白完全地或部分地取代，成為病毒的膜蛋白。膜蛋白含有兩段由疏水性氨基酸組成的電中性區(qū)域。一段在蛋白的 N 段，稱信號(hào)肽，另一段在近 C 端，稱膜嵌段。其中信號(hào)肽有將膜蛋 白引導(dǎo)和轉(zhuǎn)移入細(xì)胞膜的作用。膜嵌段因疏水而停留在膜內(nèi)。有的膜蛋白與細(xì)胞源性糖分子 結(jié)合成糖蛋白。糖蛋白除其一小部分 C 端位于膜的內(nèi)側(cè)絕大部分被擠至細(xì)胞外。膜的結(jié)構(gòu)可應(yīng)用電鏡和 X 射線觀察

5、(Caspar et al, 1962; Horrison et al, 1983; Harrison et al,1978; Rossman et al, 1985)。但病毒膜蛋白在制備時(shí)不易結(jié)晶易被破壞，而且結(jié)構(gòu)多變，可利 用電子顯微鏡觀察不固定和不染色的病毒的膜的結(jié)構(gòu)（Vogel，et al, 1986）。免疫熒光技術(shù)證 實(shí)外膜蛋白是點(diǎn)狀或顆粒狀的。根據(jù)膜蛋白在膜上定位的不同，膜蛋白分為外膜蛋白和整合膜蛋白。外膜蛋白分布于膜 的脂雙層表面。整合膜蛋白又分為兩大類，一類全部埋在脂雙層中；另一類僅疏水區(qū)在脂雙 層中，而親水區(qū)在膜的內(nèi)外兩側(cè)。膜蛋白一般是以單聚體、二聚體、三聚體甚至更多的聚合

6、體的形式存在。1.1.1 單聚體和二聚體TBE(蜱熱腦炎)病毒的膜蛋白是由單聚體和一個(gè)對(duì)稱的二聚體構(gòu)成。單聚體分為三個(gè)區(qū)，大部分是片層結(jié)構(gòu)，也有少量的螺旋，三個(gè)區(qū)之間由二硫鍵橋接。二聚體的亞單位延伸為斷裂的桶狀結(jié)構(gòu)，它的軸與病毒表面垂直，它的 C 端象 IGC 一樣折疊，由 15 個(gè)殘基靠 二硫鍵與單聚體相連（Rey，et al, 1990）。Flavivirus(黃病毒)的膜蛋白也由單聚體和二聚體構(gòu) 成。單聚體由 500 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，C 端有兩個(gè)跨膜區(qū)，其外膜蛋白為二聚體，并在酸性 條件下（pH6.5）成為三聚體（Chambers, et al, 1990）。1.1.2 二聚體Alph

7、avirus(蟲媒病毒)的膜蛋白是 80 個(gè)糖蛋白棘突。每個(gè)棘突由三個(gè)雜二聚體組成。雜二聚體由 E1（49Kd）和 E2（51Kd）構(gòu)成（Vogel,et al,1986；Paredes,et al,1993；Cheng,et al,1995；Fuller, et al, 1995；Paredes, et al, 1998），E1 有一個(gè)?；稽c(diǎn)，E2 有四個(gè)以上?；稽c(diǎn)，因而得出它們由外膜區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)膜區(qū)構(gòu)成（Garoff,et al,1980）。有人認(rèn)為 MHV(鼠腦炎病毒)外膜蛋白是?；模╕u et al,1994），但未成功應(yīng)用棕櫚酸標(biāo)記加以證實(shí)（Godet et al, 199

8、2）。1.1.3 三聚體流感病毒的膜蛋白是三聚體，分為外膜區(qū)和跨膜區(qū)，在酶的作用下會(huì)成為由 P62 和 E1 組成的雜二聚體，它是 P62 和 E1 的翻譯產(chǎn)物；E1 可轉(zhuǎn)變成由二硫鍵連接的聚合體，與 P62 聚合后自身不再聚集。1.2 病毒膜蛋白的功能由于病毒膜蛋白在結(jié)構(gòu)上有一定的共性，因而不同病毒膜蛋白的功能基本相似(見表 1)。除以上功能外，膜蛋白還可導(dǎo)致病毒的形態(tài)變化。Fisher 曾用密集氨基酸加電誘變和目標(biāo)DNA 重組技術(shù)，證實(shí)了膜蛋白在病毒顆粒的形態(tài)變化中起的作用。海洋湖沼通報(bào)2002 年78表 1Table 1病 毒 膜 蛋 白 的 主 要Main functions of v

9、iral envelope功能病毒膜蛋白的體外表達(dá)2蛋白質(zhì)的表達(dá)是為了獲取大量的目標(biāo)蛋白的而進(jìn)行的有目的性的蛋白質(zhì)的合成。將編碼所需產(chǎn)物的基因插入到運(yùn)用 DNA 重組技術(shù)構(gòu)建的質(zhì)?；蚱渌d體中，載體導(dǎo)入活細(xì)胞，表 達(dá)完成后對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)及生化特性的研究。為了進(jìn)行膜蛋白的研究，必須獲得純的膜 蛋白。由于病毒的膜蛋白含量很少難于純化。采用蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)獲得大量的目的膜蛋白通 過體外表達(dá)獲得一定量的膜蛋白，是研究病毒膜蛋白的必要前提工作。表達(dá)的方法為把目的膜蛋白的基因整合入載體而后在細(xì)胞中表達(dá)。膜蛋白的基因通過 DNA 測序獲得，載體須包含指導(dǎo)大量合成與所插入基因相應(yīng)的 mRNA 啟動(dòng)子，允許期

10、在宿 主體內(nèi)自主復(fù)制的序列、編碼的遺傳性狀以及輔助篩選含載體的細(xì)胞的序列和能增強(qiáng) mRNA 翻譯效率的序列，一般采用另一種病毒或者細(xì)菌的質(zhì)粒。而表達(dá)多是在昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物 細(xì)胞或細(xì)菌中進(jìn)行。SFV(semliki 森林病毒)的表達(dá)是通過質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)錄出 RNA，去轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞獲得的（Andersson，et al, 1997）。HSV(單純皰疹病毒)外膜糖蛋白的表達(dá)是用包 含糖蛋白基因的重組桿狀病毒感染 Sf21 細(xì)胞得到的（Welling-Wester，et al, 1998）。HTLV-I (人 體 T 細(xì)胞白血病病毒 I-型)的外膜糖蛋白的表達(dá)是把包涵編碼外膜蛋白基因片

11、段的質(zhì)粒插入到 載體再誘導(dǎo)到細(xì)菌中獲得的。表達(dá)過程中標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，有利于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量或定性的分析。Raamsan，(1999) 對(duì)目的蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記，即細(xì)胞用 35S 在體內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記而后進(jìn)行脈沖跟蹤試驗(yàn)，裂解細(xì) 胞，釋放產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀和免疫分離，用 SDS-PAGE 分析后進(jìn)行放射性定量。Tallet(2000）病 毒膜 蛋 白功 能單純皰疹病毒 (HSV-1)(1) 糖膜蛋白 gB、gD、gH 和 gL(2) 糖膜蛋白 gD(3) 糖膜蛋白 gC 或 gB誘導(dǎo)細(xì)胞融合與受體接合 調(diào)節(jié)病毒與細(xì)胞表面的結(jié)合泡狀口炎病毒 (VSV)外膜糖蛋白 G中和抗體、保護(hù)性免疫反應(yīng)鼠肝炎病毒 (

12、MHV)(1) 外膜蛋白 Epr可導(dǎo)致病毒形態(tài)變化與宿主結(jié)合并侵入靶細(xì)胞(2) 膜蛋白 M與病毒裝配有關(guān)傳染性肝炎壞死病病毒 (IHNV)外膜糖蛋白 G中和抗體和保護(hù)性免疫反應(yīng)人體 T 細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I)(1) 糖膜蛋白 C 端與細(xì)胞受體接合并侵入靶細(xì)胞免疫和中和作用(2) 跨膜糖蛋白紅細(xì)胞凝集作用semliki 森林病毒 (SFV)糖膜蛋白 E1、E2紅細(xì)胞凝集作用與細(xì)胞受體接合馬立克氏病病毒 (MDV)糖膜蛋白 B中和抗體作用蜱熱腦炎病毒 (TBE)(1) 外膜糖蛋白 E調(diào)節(jié)與細(xì)胞受體地結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞融合 誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)(2) 跨膜蛋白 E紅細(xì)胞凝集作用對(duì)表達(dá)產(chǎn)物用 SDS-

13、PAGE 分開內(nèi)-外胞質(zhì)部分，通過 Western 印記分析，用 MF2 單克隆抗體來鑒定外膜蛋白，其中膜蛋白的 C 端有組氨酸標(biāo)記物以利于純化的進(jìn)行。病毒膜蛋白的純化3病毒膜蛋白的分離純化是研究膜蛋白的基礎(chǔ)和起點(diǎn)。大多數(shù)膜蛋白是和膜整合在一起的，因而提純較為困難，需用去污劑把膜增溶下來。去污劑是提取和純化膜蛋白的關(guān)鍵性試劑（Neugebauer，1990），用去污劑溶解膜包括蛋白或目標(biāo)性提取物是純化膜蛋白的第一步。3.1 去污劑的選擇合成或天然存在的表面活性具有去污作用的物質(zhì)稱為去污劑。它是類脂類物質(zhì)，與膜的 主要成分類似，它包含一個(gè)親水的頭和一個(gè)疏水的尾。它們在脂雙層中可以和脂類競爭，并

14、比他們更具有親水性。膜蛋白以去污劑-蛋白質(zhì)的復(fù)合物形式溶解在水中，類似脂類分子，去 污劑在膜蛋白的純化中可以幫助維持膜蛋白的天然構(gòu)象。去污劑可分為幾類（Helenius，et al, 1995；Tanford，et al，1976；Helenius，et al, 1979；Hjelmeland，et al, 1984；Goneme，et al, 1978；Plusquellet，et al, 1989；Ede，et al, 1989；Brenner，et al, 1995），主要有：(a)離子型去污劑，如SDS、脫氧膽酸鈉；(b)溫和性非離子去污劑，如Triton X-100、Np-40；(c

15、)溫和性兩性去污劑, 如DDMAU、DDMAB。在膜的提取中，去污劑的選擇很關(guān)鍵。臨界微團(tuán)濃度、親水物-親脂物平衡值、荷電、紫外穿透性等是選擇去污劑的主要參考因子。3.1.1 臨界微團(tuán)濃度 (CMC，critical micelle concentration)CMC 低的去污劑容易用透析除去，但不容易溶解蛋白；CMC 高的去污劑容易使蛋白變 性。同一 CMC 的不同去污劑對(duì)膜蛋白增容能力也不一樣。Welling-Wester 等(1998)用 CMC 不同的去污劑純化 HSV-1(單純皰疹病毒 1 型)糖膜蛋白，得到的量有顯著的不同。3.1.2 親水物親脂物平衡值 (HLB, hydroph

16、ile-lipophile balance number)同一去污劑而 HLB 值不同，在膜提取中的作用也不一樣。HLB 值在 12-15 可以溶解膜，HLB 值為 15 的可以溶解脂和生物膜。HLB 在 15-20 的可以溶解外膜蛋白，超出上述范圍的只能用作潤濕劑和滲透劑。HLB 值也與膜蛋白的獲得量有關(guān)，J.Van 等(1989)曾證明 HLB 值 在 12.5 左右的去污劑對(duì)膜蛋白的增溶效果最好。3.1.3 其他去污劑的選擇還與其它的因素有關(guān)，如：荷電、紫外穿透性、對(duì)蛋白活性的影響等。一 般來說，用 280nm 檢測蛋白的不能用 Triton X-100 等有紫外吸收的去污劑；用離子交換

17、或電 泳分析的不能用帶荷電的去污劑；對(duì)蛋白活性的影響來說，離子型去污劑比溫和性兩性去污劑和溫和性非離子去污劑的影響要大。在使用去污劑純化膜蛋白前，應(yīng)用多種去污劑篩選它們?nèi)芙獾鞍撞⒈３值鞍谆钚缘哪芰Γ℉jelmeland 和 Chrambuch, 1998）。Wangler 等（1999）采用 NP-40 和超速蔗糖梯度離心提 取了細(xì)胞表達(dá)的 Alphavirus(蟲媒病毒)的外膜蛋白并獲得了結(jié)晶；Kelly 等（1974）、Mcallister 和 Wagner（1975）用非離子性去污劑 TritonX-100 和超速離心分別從 VSV(泡狀口炎病毒)、 IHNV(傳染性肝炎壞死病病毒)中提

18、取了外膜糖蛋白。海洋湖沼通報(bào)2002 年803.2 病毒膜蛋白純化技術(shù)膜在去污劑的作用下可變成蛋白質(zhì)脂去污劑的復(fù)合物而被溶解。膜被溶解后，可連 續(xù)進(jìn)行膜蛋白的純化。純化的方法主要有電泳、常規(guī)層析技術(shù)，如：凝膠過濾層析、離子交 換層析、親和層析以及高效液相層析等。3.2.1 凝膠過濾層析凝膠過濾層析亦稱分子篩或體積排阻層析。其基本原理是根據(jù)多孔的載體對(duì)不同體積、 不同形狀的分子具有不同的排阻能力，從而將蛋白質(zhì)混合物分離。由于樣品在洗脫過程中會(huì) 被不斷的稀釋，因而凝膠過濾層析一般用于膜蛋白最后階段的分離。Kelly 等（2000）用離子 性去污劑 SDS、凝膠過濾和 HPLC 純化了 Dengue

19、2(登革熱 2)病毒的外膜糖蛋白，Engeking 等（1989）用離子性去污劑 SDS 和凝膠過濾獲得了 IHNV(傳染性肝炎壞死病病毒)的糖膜蛋白。3.2.2 離子交換層析離子交換層析以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物質(zhì)的衍生物為載體。在某一 pH 值條件下， 這些載體帶有正電荷或負(fù)電荷，而當(dāng)待分離蛋白質(zhì)分子通過載體時(shí)，通過離子交換作用，使 蛋白質(zhì)分子達(dá)到分離純化的目的。由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，離子交換層析是目前分離純化蛋白質(zhì)常用的方法之一。劉強(qiáng)等(1998)用 DEAE-sepharose 結(jié)合凝膠過濾獲得了粘蟲顆粒病毒的增效因子(外膜蛋白)。3.2.3 親和層析親和層析是一種以樣品的生物活性

20、為依據(jù)的分離、分析膜蛋白方法，是利用蛋白具有能 和某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性而發(fā)展起來的層析技術(shù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過層析柱時(shí)，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結(jié)合，而不被吸附的無關(guān)成分則可隨流出液通過柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開；而后利用高濃度的底物溶液或親和力更 強(qiáng)的底物衍生溶液洗脫，目標(biāo)蛋白即可脫離層析柱上的載體。Tallet 等（2000）用兩步親和層 析與高濃度的鹽和非離子去污劑獲得了 HTLV-I(人體 T 細(xì)胞白血病病毒)的膜蛋白。3.2.4 高效液相色譜（HPLC） 高效液相層析的分離原理和操作方法與經(jīng)典的液相色譜（如離子交換、凝膠過濾等）相同，由于它具有

21、高壓洗脫的特點(diǎn)，因此，分離、分析效率極高，除此之外，高壓液相層析還可應(yīng)用于使用保留時(shí)間鑒定化合物、樣品的純度鑒定、分子量鑒定及多肽的肽譜分析等。目 前，高效液相層析已從經(jīng)典的 HPLC 柱發(fā)展到微柱、無孔徑載體以及毛細(xì)管 HPLC 柱，使 HPLC 的靈敏度大大提高。它的分析速度快、靈敏度高、分辨率好、分離化合物范圍廣、樣 品量少、體積小，并可以從洗脫液中回收具有全部生物活性的樣品。Welling-Wester（1998） 用 HPIEC(高效離子交換層析)和兩性去污劑 DDMAU 和 DDMAB 得到了 HSV(單純皰疹病毒) 的膜糖蛋白。3.2.5 電泳技術(shù)電泳技術(shù)作為分離純化蛋白質(zhì)的手段

22、之一，無論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳都是分離度 極高的分離方法。電泳可分為變性電泳、常規(guī)電泳、等電聚焦電泳和毛細(xì)管電泳。獲得分離的蛋白質(zhì)均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進(jìn)行序列分析。Schleicher 和 Schnell用 SDS-PAGE 和電洗脫獲得了純化的糖膜蛋白；Engelking 等（1989）用 SDS-PAGE 和電洗脫獲得了 IHNV(傳染性壞死病病毒)的外膜蛋白。 進(jìn)行膜蛋白的純化，一般要用兩種以上的層析方法，才能獲得電泳純的成分。若樣品含蛋白種類較多，需要用其他方法去除一些非目的蛋白，如，梯度離心、分級(jí)沉淀等，這樣才 能有利于后面的純化步驟。結(jié)束語4由于病毒的

23、膜蛋白具有多種重要功能，因而病毒膜蛋白的研究漸成熱點(diǎn)。找到病毒膜蛋白與受體靶細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，了解二者結(jié)合的機(jī)制，并找到阻斷它們與受體的結(jié)合方法，從 而治療由病毒引起的病害是當(dāng)今研究工作的重點(diǎn)。相信隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)及生物工程的高速 發(fā)展，病毒膜蛋白研究工作將取得更重要的突破。參考文獻(xiàn):1 J.薩姆布魯克 E.F.弗里奇 T.曼尼阿蒂斯著。 «分子克隆實(shí)驗(yàn)指南»。M 1995. 北京：科 學(xué)出版社。2 呂寶璋 盧 建 安明榜。受體學(xué)。 M 2000. 合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社。3 殷 震 劉景華主編。 動(dòng)物病毒學(xué)。M（第二版）。 1997. 北京：科學(xué)出版社。 4 D.R. 馬

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