蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

1、蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用 1986年，年，達(dá)爾貝科達(dá)爾貝科提出人類(lèi)基因組計(jì)劃提出人類(lèi)基因組計(jì)劃 1990年，美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)年，美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)“HGP”，9月，月，中國(guó)中國(guó)獲準(zhǔn)獲準(zhǔn)加入，負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組序列的加入，負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組序列的1% 2000年年6月月26日，草圖繪制成功日，草圖繪制成功 2003年年4月月14日，人類(lèi)基因組序列圖繪制成功日，人類(lèi)基因組序列圖繪制成

2、功改變花色的轉(zhuǎn)基因矮牽?；ǜ淖兓ㄉ霓D(zhuǎn)基因矮牽?；ㄞD(zhuǎn)入熒光素酶蛋白基因的發(fā)轉(zhuǎn)入熒光素酶蛋白基因的發(fā)熒光煙草熒光煙草藍(lán)色玫瑰藍(lán)色玫瑰 19941994年，澳大利亞科學(xué)家年，澳大利亞科學(xué)家WilkinsWilkins等人首次提出蛋白質(zhì)組概念等人首次提出蛋白質(zhì)組概念 19961996年，澳大利亞建立了第年，澳大利亞建立了第1 1個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（APAFAPAF） 20012001年年4 4月，美國(guó)成立了國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組研究組織（月，美國(guó)成立了國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組研究組織（HUPOHUPO） 2020世紀(jì)世紀(jì)9090年代中期年代中期 ，蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在，蛋白質(zhì)組學(xué)

3、以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：n美國(guó)國(guó)家癌癥研究院美國(guó)國(guó)家癌癥研究院（National Cancer National Cancer InstituteInstitute）和）和食品藥品監(jiān)督管理局（食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Food and Drug AdministrationDrug Administration）共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建立立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。nCeleraCelera公司投資上億美元獨(dú)

4、自啟動(dòng)了全面鑒定公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類(lèi)匯總?cè)撕头诸?lèi)匯總?cè)祟?lèi)組織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及類(lèi)組織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作。作。n我國(guó)也于我國(guó)也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)學(xué)研討會(huì) n2003成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織（成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），），并分別于并分別于2003年年9月、月、2004年年8月以及月以及2005年年8月月召開(kāi)了中國(guó)

5、蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大召開(kāi)了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，會(huì)，2004年年10月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。質(zhì)組學(xué)會(huì)議。n科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)“973”計(jì)計(jì)劃項(xiàng)目和劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。列為重點(diǎn)項(xiàng)目。n2003年年12月月15日，國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織負(fù)責(zé)人在北京宣布，日，國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織負(fù)責(zé)人在北京宣布，國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組計(jì)劃正式啟動(dòng)，國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組計(jì)劃正式啟動(dòng)

6、，“人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”和和“人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃”兩大項(xiàng)目首先開(kāi)始執(zhí)行，其中兩大項(xiàng)目首先開(kāi)始執(zhí)行，其中“人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”由中國(guó)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)執(zhí)行，這是我國(guó)由中國(guó)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)執(zhí)行，這是我國(guó)科學(xué)家第一次領(lǐng)導(dǎo)執(zhí)行重大國(guó)際科技協(xié)作計(jì)劃?？茖W(xué)家第一次領(lǐng)導(dǎo)執(zhí)行重大國(guó)際科技協(xié)作計(jì)劃。 n首次由我國(guó)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的國(guó)際重大科研合作項(xiàng)目首次由我國(guó)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的國(guó)際重大科研合作項(xiàng)目人類(lèi)肝人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃，被宣告取得階段性新進(jìn)展。幾年來(lái)圍繞人類(lèi)臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃，被宣告取得階段性新進(jìn)展。幾年來(lái)圍繞人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組的肝臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜、修飾譜及其相互作用的連

7、鎖圖表達(dá)譜、修飾譜及其相互作用的連鎖圖等九大等九大科研任務(wù)，我國(guó)科學(xué)家已經(jīng)成功測(cè)定出科研任務(wù)，我國(guó)科學(xué)家已經(jīng)成功測(cè)定出6788個(gè)個(gè)高可信度的中國(guó)高可信度的中國(guó)成人肝臟蛋白質(zhì)，系統(tǒng)構(gòu)建了國(guó)際上第一張人類(lèi)器官蛋白質(zhì)組成人肝臟蛋白質(zhì)，系統(tǒng)構(gòu)建了國(guó)際上第一張人類(lèi)器官蛋白質(zhì)組“藍(lán)圖藍(lán)圖”；發(fā)現(xiàn)了包含；發(fā)現(xiàn)了包含1000余個(gè)余個(gè)“蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)”相互作用的相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖；建立了網(wǎng)絡(luò)圖；建立了2000余株蛋白質(zhì)抗體。余株蛋白質(zhì)抗體。蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)組學(xué)的二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述三

8、、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者WilliamsWilliams和和WilkinsWilkins于于19941994年首先提出，源于蛋白年首先提出，源于蛋白質(zhì)（質(zhì)（proteinprotein）與基因組（）與基因組（genomegenome）兩）兩個(gè)詞的雜合個(gè)詞的雜合, ,意指意指proteins expressed proteins expressed by a genomeby a genome，即，即“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)織的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)

9、”。 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念蛋白質(zhì)組學(xué)的概念對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。質(zhì)。 同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同中的表達(dá)情況各不相同 。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。蛋白質(zhì)組是：蛋白質(zhì)組是： 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化動(dòng)態(tài)變化的的蛋白質(zhì)組成蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)成份、表達(dá)水平與修

10、飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。 n了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類(lèi)；了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類(lèi)；n明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類(lèi)似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類(lèi)似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；n描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展二

11、、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述研究方法概述四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組研究更為復(fù)雜和困難：蛋白質(zhì)組研究更為復(fù)雜和困難：n 蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過(guò)基因數(shù)目蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過(guò)基因數(shù)目n 蛋白質(zhì)隨時(shí)間和空間而變化蛋白質(zhì)隨時(shí)間和空間而變化 當(dāng)前主要任務(wù)：當(dāng)前主要任務(wù)：發(fā)展發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、一、

12、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)n定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究n蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)研究蛋白質(zhì)組的研究蛋白質(zhì)組的組成成分組成成分 支撐技術(shù)主要有支撐技術(shù)主要有雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳、以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)以質(zhì)譜為代表的蛋白

13、質(zhì)鑒定技術(shù)及及生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)n定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究n蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 通?？刹捎猛ǔ？刹捎眉?xì)胞或組織細(xì)胞或組織中的全

14、蛋白質(zhì)組分進(jìn)中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。行蛋白質(zhì)組分析。 也可以進(jìn)行也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。 樣品預(yù)分級(jí)的主要方法樣品預(yù)分級(jí)的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)靈敏度測(cè)靈敏度。

15、臨床樣本都是由多種細(xì)胞或組織混合而成，如腫瘤臨床樣本都是由多種細(xì)胞或組織混合而成，如腫瘤中癌變上皮細(xì)胞總是與血管、間質(zhì)細(xì)胞等混雜一起。中癌變上皮細(xì)胞總是與血管、間質(zhì)細(xì)胞等混雜一起。 激光捕獲顯微切割激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞群。定的細(xì)胞或細(xì)胞群。 LCM具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)n快速簡(jiǎn)單、有效減少交叉污染?？焖俸?jiǎn)單、有效減少交叉污染。n樣品的切割與分離由激光一步完成，并可以保持被分離的樣品的切割與分離由激光一步完成，并可以保持被分離的樣品

16、的完整性。樣品的完整性。n結(jié)合免疫熒光能夠基于組織細(xì)胞的表型和功能特征進(jìn)行分結(jié)合免疫熒光能夠基于組織細(xì)胞的表型和功能特征進(jìn)行分離樣品組分。離樣品組分。n對(duì)制樣的要求靈活多樣，使用范圍較廣。對(duì)制樣的要求靈活多樣，使用范圍較廣。 通過(guò)通過(guò)LCM對(duì)組織切片進(jìn)行切割與分離可以分離收集從形態(tài)對(duì)組織切片進(jìn)行切割與分離可以分離收集從形態(tài)上（普通染色），表型或功能上（熒光染色）可以辨認(rèn)均一性上（普通染色），表型或功能上（熒光染色）可以辨認(rèn)均一性的細(xì)胞群體，從而的細(xì)胞群體，從而克服了組織不均一克服了組織不均一的特點(diǎn)，提高了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)的特點(diǎn)，提高了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，這在腫瘤生物學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。確性和可靠性

17、，這在腫瘤生物學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)n定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究n蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(two-dimensiona

18、l electrophoresis，2-DE)：利用蛋白質(zhì)的：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量等電點(diǎn)和分子量，結(jié)合凝膠化，結(jié)合凝膠化學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。第第1向基于蛋白質(zhì)的向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同等電點(diǎn)不同用用等電聚焦分離等電聚焦分離，具有，具有相同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)無(wú)論其分子大小，在電場(chǎng)的作用下都相同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)無(wú)論其分子大小，在電場(chǎng)的作用下都會(huì)用聚焦在某一特定位置即等電點(diǎn)處；第會(huì)用聚焦在某一特定位置即等電點(diǎn)處；第2向則按向則按分子量的分子量的不同不同用用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。二維平

19、面上分開(kāi)。第一向分離第一向分離等電聚焦等電聚焦蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同的蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同的pH環(huán)境中可以帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷。環(huán)境中可以帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷。對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)都有一個(gè)特定的對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)都有一個(gè)特定的pH，此時(shí)蛋白質(zhì)的靜電荷為零，此，此時(shí)蛋白質(zhì)的靜電荷為零，此pH值值即該即該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。將蛋白質(zhì)樣品加載至。將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，它會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中，蛋白分子可能獲它會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并且隨著移動(dòng)的進(jìn)

20、行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。得或失去質(zhì)子，并且隨著移動(dòng)的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)pH位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。聚焦是一個(gè)與聚焦是一個(gè)與pH相關(guān)的平衡過(guò)程：蛋白質(zhì)以不同的速率靠近并最終停留在它相關(guān)的平衡過(guò)程：蛋白質(zhì)以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的們各自的pI值；在等電聚焦過(guò)程中，蛋白質(zhì)可以從各個(gè)方向移動(dòng)到它的恒定值；在等電聚焦過(guò)程中，蛋白質(zhì)可以從各個(gè)方向移動(dòng)到它的恒定位點(diǎn)。位點(diǎn)。第二向分離第二向分離SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳雙向電泳的第二向是將雙向

21、電泳的第二向是將IPG膠條中經(jīng)過(guò)第一向分離的蛋白轉(zhuǎn)移到第二向膠條中經(jīng)過(guò)第一向分離的蛋白轉(zhuǎn)移到第二向SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量或分子量凝膠上，根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量或分子量(MW)大小與第大小與第一相垂直的分離。一相垂直的分離。蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉(SDS)結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合復(fù)合物，由于物，由于SDS是一種強(qiáng)陰離子去垢劑所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)是一種強(qiáng)陰離子去垢劑所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，分子原有的電荷量，能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得凝膠中電泳

22、遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響而主要取決于蛋白凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響而主要取決于蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量大小質(zhì)分子的質(zhì)量大小，其遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，在蛋白質(zhì)，其遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，在蛋白質(zhì)組研究中。需要在同樣的條件下同時(shí)走多塊膠，這對(duì)凝膠與凝膠之間組研究中。需要在同樣的條件下同時(shí)走多塊膠，這對(duì)凝膠與凝膠之間的比較十分重要的比較十分重要可分離可分離10100 kD分子量的蛋白質(zhì)分子量的蛋白質(zhì) 高靈敏度和高分辨率高靈敏度和高分辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理 與質(zhì)譜分析匹配與質(zhì)譜分析匹配 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)的缺點(diǎn)技

23、術(shù)的缺點(diǎn) 極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。 膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。 u 液相色譜法液相色譜法 liquid chromatography，LCu毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法 capillary electrophoresis，CEu液相色譜液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（L LPLPLC-MS/MSC-MS/MS） 蛋白質(zhì)混合物直接通過(guò)蛋白質(zhì)混合物直接通

24、過(guò)液相色譜分離液相色譜分離以代替以代替2-DE的的分離，然后進(jìn)入分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)系統(tǒng)獲得獲得肽段分子量肽段分子量，再通過(guò)，再通過(guò)串聯(lián)串聯(lián)MS技術(shù)技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒，得到部分序列信息，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。定蛋白質(zhì)。 根據(jù)蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)帶電性及疏水性帶電性及疏水性不同，用不同，用MS分離多肽復(fù)合物。分離多肽復(fù)合物。離子交換色譜離子交換色譜是通過(guò)溶質(zhì)在離子交換色譜固定相上具有不同是通過(guò)溶質(zhì)在離子交換色譜固定相上具有不同的保留能力，而實(shí)現(xiàn)樣品分離的色譜技術(shù)，而的保留能力，而實(shí)現(xiàn)樣品分離的色譜技術(shù)，而反相液相色譜反相液相色譜是基于是基于溶質(zhì)疏水性的

25、差異溶質(zhì)疏水性的差異而實(shí)現(xiàn)分離的色譜技術(shù)。通過(guò)這兩而實(shí)現(xiàn)分離的色譜技術(shù)。通過(guò)這兩種色譜模式的聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)種色譜模式的聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣品的二維分離。復(fù)雜生物樣品的二維分離。 u多維多維色譜技術(shù)（色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS） u多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensional protein identification technology) 將不同分離模式的將不同分離模式的色譜柱以串聯(lián)方式合并于同一根色譜柱中進(jìn)行，在同一根色譜色譜柱以串聯(lián)方式合并于同一根色譜柱中進(jìn)行，在同一根色譜柱的前半部分裝填柱的前半部分裝填強(qiáng)陽(yáng)離子色譜填料強(qiáng)陽(yáng)離子色譜填料，后部分裝

26、填，后部分裝填反相液相色反相液相色譜填料譜填料，該方法可對(duì)，該方法可對(duì)樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)n定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究n蛋白

27、質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)傳統(tǒng)方法：傳統(tǒng)方法：EdmanEdman降解法降解法: :EdmanEdman降解（降解（Edman degradationEdman degradation）：是測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，主要）：是測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，主要是從是從蛋白質(zhì)或多肽氨基末端蛋白質(zhì)或多肽氨基末端進(jìn)行分析。由埃德曼（進(jìn)行分析。由埃德曼（P PEdmanEdman）在上世紀(jì)）在上世紀(jì)5050年代所創(chuàng)立。分為年代所創(chuàng)立。分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個(gè)步驟。首先在等幾個(gè)步驟。首先在pH9.0pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯的堿性環(huán)境下，將

28、異硫氰酸苯酯(PhN=C=S(PhN=C=S，PITC)PITC)和蛋白質(zhì)或多肽和蛋白質(zhì)或多肽N N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)(TFA)處理耦合后產(chǎn)物，處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的將多肽或蛋白的N N一端第一個(gè)肽鍵選擇性的切斷，釋放一端第一個(gè)肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PT

29、H-(PTH-氨基酸氨基酸) )；最后；最后以色譜法鑒定出降解下來(lái)的以色譜法鑒定出降解下來(lái)的PTH-PTH-氨基酸種類(lèi)，從而得到蛋白質(zhì)或氨基酸種類(lèi)，從而得到蛋白質(zhì)或多肽多肽N N端端序列信息。序列信息。EdmanEdman降解法的優(yōu)點(diǎn)是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應(yīng)降解法的優(yōu)點(diǎn)是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應(yīng)產(chǎn)率和回收率都相當(dāng)高，因此反應(yīng)副產(chǎn)物少，用色譜可以準(zhǔn)確鑒定。產(chǎn)率和回收率都相當(dāng)高，因此反應(yīng)副產(chǎn)物少，用色譜可以準(zhǔn)確鑒定。 一些傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析技術(shù)如蛋白質(zhì)序列分析技術(shù)（一些傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析技術(shù)如蛋白質(zhì)序列分析技術(shù)（Edman降解法降解法, 1950），仍然可用于當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究），仍然

30、可用于當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究。其缺點(diǎn)是難其缺點(diǎn)是難于實(shí)現(xiàn)高通量，同時(shí)對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定上其靈敏度難于達(dá)于實(shí)現(xiàn)高通量，同時(shí)對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定上其靈敏度難于達(dá)到要求到要求。 A-R-G-F-L-E-K-LA-R-G-F-L-E-K-L ( (得到部分序列得到部分序列) )491491蛋白質(zhì)微蛋白質(zhì)微量序列儀量序列儀印漬轉(zhuǎn)移酶解提取肽混合物毛細(xì)管HPLC儀收集肽于PVDF膜 PVDF膜通過(guò)通過(guò)Edman降解對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線降解對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線 雙向電泳分離新型蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)新型蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 質(zhì)譜（質(zhì)譜（MSMS）法）法 基本原理基本原理：質(zhì)譜法質(zhì)譜法(

31、Mass Spectrometry,MS)(Mass Spectrometry,MS)即用電即用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片，場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片，有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離子、亞穩(wěn)離子、負(fù)離子和離子分子相互作用產(chǎn)生的離子）子、亞穩(wěn)離子、負(fù)離子和離子分子相互作用產(chǎn)生的離子）按它們的按它們的質(zhì)荷比質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法。分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法。測(cè)出離子準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)出離子準(zhǔn)確質(zhì)量即可確定離子的化合物組成即可確定離子的化合物組成。樣品分子。樣品分子離子化離子化后，根據(jù)離

32、子后，根據(jù)離子間間質(zhì)荷比（質(zhì)荷比（m/zm/z）的差異來(lái)分離并確定的差異來(lái)分離并確定樣品的分子量樣品的分子量。 MAIDI-TOFESI-MS/MS 酶解脫鹽濃縮飛行時(shí)間質(zhì)譜儀飛行時(shí)間質(zhì)譜儀電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀毛細(xì)管HPLC儀點(diǎn)樣板序列標(biāo)簽(PST)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)搜索雙向電泳分離 蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線 肽肽質(zhì)指紋（PMF）質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)路線圖質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)路線圖 基質(zhì)輔助激光解吸基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser de

33、sorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）MALDI-TOF質(zhì)譜儀：靈敏度高（可達(dá)質(zhì)譜儀：靈敏度高（可達(dá)fmol），分析速度快，），分析速度快，譜圖簡(jiǎn)單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小譜圖簡(jiǎn)單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小 電噴霧質(zhì)譜電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）電噴霧質(zhì)譜儀：靈敏度高）電噴霧質(zhì)譜儀：靈敏度高,能與液相色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離手段聯(lián)用能與液相色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離手段聯(lián)用 主要質(zhì)譜類(lèi)型主要質(zhì)譜類(lèi)型

34、鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線 基質(zhì)輔助激光解吸基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜電離飛行時(shí)間質(zhì)譜通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖（peptide mass fingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 電噴霧質(zhì)譜電噴霧質(zhì)譜通過(guò)測(cè)出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸通過(guò)測(cè)出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì)聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì) 組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù) 兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF） 傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振

35、質(zhì)譜（傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS） 表面增強(qiáng)激光解吸表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS） 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)生物信息學(xué)n定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究

36、n蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)應(yīng)應(yīng) 用用 1、對(duì)雙向電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析，識(shí)別差異表、對(duì)雙向電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析，識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；構(gòu)建雙向凝膠電泳圖譜。達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；構(gòu)建雙向凝膠電泳圖譜。2、單獨(dú)或綜合運(yùn)用質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)、氨基酸測(cè)序、單獨(dú)或綜合運(yùn)用質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)、氨基酸測(cè)序結(jié)果等查詢數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定蛋白質(zhì)。結(jié)果等查詢數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定蛋白質(zhì)。3、構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。、構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ) u瑞士的瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類(lèi)最擁有目前世界上最大、種類(lèi)最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。

37、（多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。（http:/www.expasy.ch/）u目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫(kù)是目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫(kù)是NRDB 和和dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)。uNRDB是由是由NCBI創(chuàng)建的，是創(chuàng)建的，是NCBI的的BLAST搜索程搜索程序的默認(rèn)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)由序的默認(rèn)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)由GenPept（由（由GenBank 編碼序列自動(dòng)翻譯而成數(shù)據(jù)庫(kù)）、編碼序列自動(dòng)翻譯而成數(shù)據(jù)庫(kù)）、SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)、數(shù)據(jù)庫(kù)、SPupdate（每周更新的（每周更新的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)）、數(shù)據(jù)庫(kù)）、PIR（蛋白質(zhì)信息資源（蛋白質(zhì)信息資源 ）和）和GenPeptUpdate(每

38、天更新的每天更新的GenPept)數(shù)據(jù)庫(kù)復(fù)數(shù)據(jù)庫(kù)復(fù)合而合而成。因此該數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)較完全的，包含最新信息的成。因此該數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)較完全的，包含最新信息的數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)。u dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐）和歐洲生物信息學(xué)研究所（洲生物信息學(xué)研究所（EBI）共同編輯，包括）共同編輯，包括許多生物體的表達(dá)序列標(biāo)簽（許多生物體的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）肽）肽序列序列標(biāo)標(biāo)簽簽(PST)或部分序列信息或部分序列信息蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白

39、質(zhì)組研究中的樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)n定量定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究n蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 概念：概念：把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜體系把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定。中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定。 l 低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)困難低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)困難l 蛋白質(zhì)表

40、達(dá)量差異很小，如在蛋白質(zhì)表達(dá)量差異很小，如在50%以下時(shí)，精確以下時(shí)，精確定量成為瓶頸定量成為瓶頸 l 蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)變化蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)變化 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(2-DE) 熒光差異顯示雙向電泳（熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE） 結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念。標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念。兩種樣品中的蛋白質(zhì)采用不同的兩種樣品中的蛋白質(zhì)采用不同的熒光標(biāo)記后混合，進(jìn)行熒光標(biāo)記后混合，進(jìn)行2-DE，用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)在兩種樣品中，用來(lái)檢測(cè)蛋白

41、質(zhì)在兩種樣品中表達(dá)表達(dá)情況，極情況，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。在。在DIGE技術(shù)中，每個(gè)蛋白技術(shù)中，每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件可全自動(dòng)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件可全自動(dòng)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測(cè)到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測(cè)到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。 原理：對(duì)于具有原理：對(duì)于具有相同離子化能力相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽，可以通過(guò)比較質(zhì)譜峰的的蛋白質(zhì)或多肽，可以通過(guò)比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)量。強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)

42、量。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法n蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離n蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定n蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)n定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、二、蛋白質(zhì)組功能模式蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法的研究方法n蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究n蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)

43、的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。 主要研究目標(biāo) 翻譯后修飾翻譯后修飾糖基化糖基化乙?；阴；谆谆然然蜴I二硫鍵磷酸化磷酸化研究面臨的困難：研究面臨的困難： 修飾肽的檢測(cè)的高靈敏度方法修飾肽的檢測(cè)的高靈敏度方法 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的定量分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾的定量分析 合適的修飾狀態(tài)下處理和電離條件合適的修飾狀態(tài)下處理和電離條件 測(cè)定工作量巨大測(cè)定工作量巨大 生命的基本過(guò)程是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同生命的基本過(guò)程是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用

44、（蛋白質(zhì)復(fù)合體、多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)）作用（蛋白質(zhì)復(fù)合體、多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)）1酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立 。典型的真核生物轉(zhuǎn)錄因子， 如GAL4、GCN4等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域： DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain)。前者可識(shí)別DNA上的特異序列， 并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游， 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用， 啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)1

45、.使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系2.篩選篩選cDNA文庫(kù)文庫(kù)3.真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況間相互作用情況4.不需分離靶蛋白不需分離靶蛋白5.敏感性高敏感性高 缺缺 點(diǎn)點(diǎn)1.假陽(yáng)性結(jié)果假陽(yáng)性結(jié)果 2.假陰性結(jié)果假陰性結(jié)果 3.限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用4.不能檢測(cè)依靠翻譯后修飾的相互作用不能檢測(cè)依靠翻譯后修飾的相互作用 靶蛋白制備靶蛋白制備 蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化 蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定 基本步驟：基本步驟：包括包括: 基本原理：基本原理：將某種蛋白質(zhì)以將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵共價(jià)

46、鍵固定在基質(zhì)（如瓊固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含相互作用蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過(guò)柱，先脂糖）上，含相互作用蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過(guò)柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶）鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。蛋白的結(jié)合蛋白。 得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌（bait） 獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質(zhì)獲得足夠量、純度高的與誘餌

47、相互作用的蛋白質(zhì) 原理：以原理：以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。定靶蛋白的結(jié)合蛋白。 抗抗p53抗體與抗體與HNE1和和HNE2總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀 SDS-PAGE分離免疫沉淀復(fù)合物分離免疫沉淀復(fù)合物 切取切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS

48、）分析，得到相應(yīng)的肽序列標(biāo)簽）分析，得到相應(yīng)的肽序列標(biāo)簽 搜索數(shù)據(jù)庫(kù)搜索數(shù)據(jù)庫(kù) 生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)之間的相互作用生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)之間的相互作用所有蛋白質(zhì)與靶蛋白的相互作用所有蛋白質(zhì)與靶蛋白的相互作用可檢測(cè)依賴于修飾的蛋白質(zhì)相互作用可檢測(cè)依賴于修飾的蛋白質(zhì)相互作用 A. 靈敏性不高靈敏性不高 B. 假陽(yáng)性假陽(yáng)性C. 受免疫球蛋白的干擾較大受免疫球蛋白的干擾較大 基本原理：基本原理：將高度密集排列的蛋白分將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋品中的靶蛋白

49、，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析。白進(jìn)行定性和定量分析。蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述四、四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用（一）（一）研究腫瘤發(fā)病機(jī)理、尋找用于腫瘤診斷和治療研究腫瘤發(fā)病機(jī)理、尋找用于腫瘤診斷和治療的生物標(biāo)志物的生物標(biāo)志物 運(yùn)用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，通過(guò)比較腫瘤組織（細(xì)胞）和正常組織（細(xì)胞）或腫瘤發(fā)展不同階段組織中，蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與癌變相關(guān)的特異性蛋白

50、質(zhì)，這些腫瘤相關(guān)的特異蛋白質(zhì)不僅可為認(rèn)識(shí)和研究腫瘤發(fā)病機(jī)理提供線索，而且可作為腫瘤診斷和治療的生物標(biāo)志物。如Celis等對(duì)膀胱鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和移形細(xì)胞癌（TCC）的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較研究，在膀胱癌病人的尿液中找到4種與膀胱癌相關(guān)的蛋白質(zhì)：其中銀屑素是SCC的生物標(biāo)志，可用于SCC的早期診斷、鑒別診斷和病情監(jiān)控。 。（二）（二）發(fā)現(xiàn)腫瘤藥物作用的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)腫瘤藥物作用的靶點(diǎn) 藥物多是通過(guò)特異地作用于體內(nèi)的靶蛋白質(zhì)而重新調(diào)整病人藥物多是通過(guò)特異地作用于體內(nèi)的靶蛋白質(zhì)而重新調(diào)整病人的生理功能達(dá)到治療目的。新的藥物靶蛋白在藥學(xué)研究中有重要的生理功能達(dá)到治療目的。新的藥物靶蛋白在藥學(xué)研究中有重要作用

51、?；蚪M研究提示，作用?；蚪M研究提示，控制人類(lèi)疾病的潛在藥物靶蛋白控制人類(lèi)疾病的潛在藥物靶蛋白，粗略，粗略估計(jì)大約有估計(jì)大約有5000-100005000-10000個(gè)。然而在過(guò)去的個(gè)。然而在過(guò)去的100100年年發(fā)現(xiàn)的藥物靶蛋發(fā)現(xiàn)的藥物靶蛋白只有白只有500-1000500-1000個(gè)。因此后基因組時(shí)代的一個(gè)緊迫任務(wù)是發(fā)現(xiàn)這個(gè)。因此后基因組時(shí)代的一個(gè)緊迫任務(wù)是發(fā)現(xiàn)這些藥物靶蛋白，為開(kāi)發(fā)治療人類(lèi)疾病的新藥提供依據(jù)。些藥物靶蛋白，為開(kāi)發(fā)治療人類(lèi)疾病的新藥提供依據(jù)。 用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，通過(guò)比較腫瘤組織（細(xì)胞）和正常組用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，通過(guò)比較腫瘤組織（細(xì)胞）和正常組織（細(xì)胞）或腫瘤發(fā)展不同階

52、段組織中，蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表織（細(xì)胞）或腫瘤發(fā)展不同階段組織中，蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性蛋白質(zhì)腫瘤特異性蛋白質(zhì)，這些，這些蛋白質(zhì)不僅可作為蛋白質(zhì)不僅可作為腫瘤診斷的標(biāo)志物腫瘤診斷的標(biāo)志物，而且可作為，而且可作為抗腫瘤藥物作抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)用靶點(diǎn)，用于，用于治療腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)治療腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。 （三）（三）腫瘤藥物作用機(jī)理研究腫瘤藥物作用機(jī)理研究 目前，一些抗腫瘤藥物在體內(nèi)的作用機(jī)理并不清楚。應(yīng)用蛋目前，一些抗腫瘤藥物在體內(nèi)的作用機(jī)理并不清楚。應(yīng)用蛋白質(zhì)組研究技術(shù)，分析藥物處理過(guò)的細(xì)胞白質(zhì)組研究技術(shù)，分析

53、藥物處理過(guò)的細(xì)胞/ /組織或體液表達(dá)的蛋組織或體液表達(dá)的蛋白質(zhì)組，比較治療前后的蛋白質(zhì)組的差異、鑒定其中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變白質(zhì)組，比較治療前后的蛋白質(zhì)組的差異、鑒定其中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變化的蛋白質(zhì)，可揭示藥物的作用機(jī)理?；牡鞍踪|(zhì)，可揭示藥物的作用機(jī)理。 如比較抗肝癌化合物如比較抗肝癌化合物OGT 719OGT 719和和5-FU5-FU處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞株的蛋處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞株的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)二者處理過(guò)的細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生了類(lèi)似的白質(zhì)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)二者處理過(guò)的細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生了類(lèi)似的變化，這提示變化，這提示OGT 719OGT 719與已知的與已知的5-FU5-FU的作用機(jī)制類(lèi)似，其中核糖的作用機(jī)制類(lèi)似，其中核糖體體RNARNA結(jié)合蛋白（嘧啶合成過(guò)程中的一種重要蛋白）變化顯著，結(jié)合蛋白（嘧啶合成過(guò)程中的一種重要蛋白）變化顯著，可能是二者作用的靶點(diǎn)?？赡苁?/p>