綠膿桿菌檢驗(yàn)技術(shù)

1、化妝品中銅綠假單胞菌化妝品中銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的檢測(cè)的檢測(cè)目的：1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測(cè)的基本過(guò)程。2.掌握幾種培養(yǎng)基的配置方法。3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。原理： 銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落大小不一，平均直徑2mm3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態(tài)。氧化酶陽(yáng)性，能產(chǎn)生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產(chǎn)生氮?dú)?，?2條件下可以生長(zhǎng)，可與類似菌區(qū)別。操作步驟 檢樣前化妝品的處理 接樣于營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌，37，12h，140rpm培養(yǎng)分離培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物接于十六烷基三甲基溴

2、化銨平 板， 37，18-24h 染色鏡檢 配十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌不能生長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)完全受到抑制） 配綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面培養(yǎng)基操作步驟 特征性檢驗(yàn)氧化酶 綠膿菌素 硝酸鹽還原 明膠液化 42 生長(zhǎng) 試驗(yàn) 試驗(yàn) 產(chǎn)氣試驗(yàn) 試驗(yàn) 試驗(yàn)取菌+ 1滴 接菌，37 接菌 接菌 接菌二甲基對(duì) 24h +氯仿 37 24h 37 24h 42 24h 苯二胺 移出+鹽酸紫紅色（+） 紫紅色（+） 有氣體（+） 溶解成液狀（+） 生長(zhǎng)（+） 不變色（-） 不變色（-） 無(wú)氣體（-） 未溶解（-） 不生長(zhǎng)（-） 實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)

3、基的制備及細(xì)菌的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆张囵B(yǎng)基制備的原理和方法掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)了解滅菌方法實(shí)驗(yàn)原理 不同的微生物生長(zhǎng)繁殖都需要提供一定的營(yíng)養(yǎng)條件，在實(shí)驗(yàn)室中，微生物的營(yíng)養(yǎng)是由培養(yǎng)基來(lái)提供的。培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。 除營(yíng)養(yǎng)條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才表現(xiàn)出最大生命力，因此，應(yīng)針對(duì)不同的微生物將培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到適當(dāng)范圍。 操作步驟按培養(yǎng)基按培養(yǎng)基配方稱量配方稱量加水加加水加熱熔化熱熔化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值值分裝分裝包裝包裝滅菌滅菌備用備用操作步驟 1.綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝試管 高壓 制成斜面2.明膠培養(yǎng)基

4、300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝試管 高壓 直立制成高層3.硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝有小倒管的試管 高壓 直立制成高層4.普通瓊脂斜面培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)pH 分裝試管 高壓 制成斜面注意事項(xiàng)培養(yǎng)基溶解時(shí)，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。加熱后應(yīng)補(bǔ)足液量。注意做好標(biāo)記。細(xì)菌的分離培養(yǎng)原理： 通過(guò)劃線，將混雜的細(xì)菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落(colony)。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個(gè)菌落，移種培養(yǎng)后，即得到純種細(xì)菌。方法：平板劃線法有幾種，可根據(jù)不同情況選用其中一種。 (1)平行劃線

5、法 此法適用于含菌不多的液體標(biāo)本，如腦脊液(CSF)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標(biāo)本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。將平板轉(zhuǎn)180角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。 將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37培養(yǎng)。(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測(cè)標(biāo)本，如糞便，喀痰、細(xì)菌固體培養(yǎng)物等。劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標(biāo)本涂開并在平板的1/51/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。將平板轉(zhuǎn)約70角，待接種環(huán)冷卻后，

6、使接種環(huán)通過(guò)已劃線的1區(qū)57次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過(guò)火焰滅菌。再轉(zhuǎn)平板約70，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。重復(fù)上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)二 染色鏡檢及五項(xiàng)指標(biāo)試驗(yàn)革蘭氏染色方法 涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色鏡檢鏡檢1涂片：取一潔凈的載玻片，用記號(hào)筆在載玻片做好標(biāo)記，涂片：取一潔凈的載玻片，用記號(hào)筆在載玻片做好標(biāo)記，并在載玻片中間滴一小滴生理并在載玻片中間滴一小滴生理.鹽水，以無(wú)菌接種環(huán)挑取鹽水，以無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈無(wú)油，否則菌液涂不開。少量菌

7、體涂片，玻片要潔凈無(wú)油，否則菌液涂不開。 為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細(xì)菌死殘留的細(xì)菌。2干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦?；鹧嫔喜康臒釟鈱又泻婵?，但切勿將涂膜烤焦。3固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過(guò)三次，以固定之。此時(shí)殺死大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定過(guò)

8、三次，以固定之。此時(shí)殺死大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定于玻片上，以免在染色或水洗過(guò)程中被沖掉。于玻片上，以免在染色或水洗過(guò)程中被沖掉。 4染色：染色： 初染初染:將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，1min。 媒染媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。 脫色：水洗后用脫色：水洗后用95乙醇脫色，并搖動(dòng)玻片，直至流下的乙醇脫色，并搖動(dòng)玻片，直至流下的液體無(wú)色為止，約需液體無(wú)色為止，約需0.5min。 復(fù)染：水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色，復(fù)染：水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色，1min。 水洗，用濾紙吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行鏡檢。水洗，用濾紙吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行

9、鏡檢。5鏡檢：鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌（成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（陰性菌（G-）。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。 注意事項(xiàng)：酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過(guò)度，酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過(guò)度，則革蘭氏陽(yáng)性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色則革蘭氏陽(yáng)性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可

10、能被誤染為革蘭氏陽(yáng)性菌，不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽(yáng)性菌，所以脫色時(shí)間要很好掌握。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片所以脫色時(shí)間要很好掌握。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時(shí)取菌要少，涂片薄而均勻?yàn)楹癖〉挠绊?，一般涂片時(shí)取菌要少，涂片薄而均勻?yàn)楹?。好。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會(huì)影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽(yáng)性菌的陳舊培養(yǎng)物也有會(huì)影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽(yáng)性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在在1824h1824h之內(nèi)。之內(nèi)。 革蘭氏染色方法操作步驟涂

11、片生理生理鹽水鹽水接種環(huán)接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫 碘 液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色0.5min固定初初染染1min復(fù)染1min干燥鏡檢 復(fù)紅銅綠假單胞菌鏡下形態(tài)圖示：氧化酶試驗(yàn)原理：有氧呼吸過(guò)程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統(tǒng)扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細(xì)胞色素（reducedcytochrome）氧化，產(chǎn)生水或過(guò)氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實(shí)驗(yàn)有助于區(qū)分奈瑟氏菌屬（Neisseria）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽(yáng)性(oxidasepositive)，與腸道桿菌科（Enterobacteriaceae）此科

12、之細(xì)菌為氧化酵素陰性（oxidasenegative）。方法： 白色濾紙片 取菌+1滴1% 二甲基對(duì)苯二胺 1530s 變紅色（+） 不變色（-）實(shí)驗(yàn)三 結(jié)果觀察及報(bào)告綠膿菌素實(shí)驗(yàn)：23個(gè)可疑菌落綠膿菌素培養(yǎng)基37 24h 35mL氯仿振蕩 提取液呈藍(lán)色取液體于一新試管+1mL1mol/L鹽酸 上層鹽酸內(nèi)變?yōu)榧t色為陽(yáng)性，不變色則為陰性。硝酸鹽還原產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)：可疑菌落硝酸鹽蛋白胨水 37 24h 小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生為陽(yáng)性，否則陰性。明膠液化實(shí)驗(yàn)：可疑菌落穿刺接種于明膠培養(yǎng)基 37 24h 取出放冰箱1030min 呈溶解狀為陽(yáng)性，不溶解則為陰性。42生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) ：可疑菌落普通瓊脂斜面42 24h銅綠

13、假單胞菌生長(zhǎng)，而近似的熒光假單胞菌不能生長(zhǎng) 。結(jié)果判斷 氧化酶（+）綠膿菌素（+） 可報(bào)告檢出 典型或可疑菌落 氧化酶（+）綠膿菌素（-） 明膠液化（+） 可報(bào)告檢出 硝酸產(chǎn)氣（+） 42 生長(zhǎng)（+） 革蘭氏染色（革蘭氏染色（Gram staining）:革蘭氏染色法是由丹麥醫(yī)生Gram于1884年創(chuàng)立，其簡(jiǎn)要操作分初染媒染脫色復(fù)染。如果染色得當(dāng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)G+菌體呈藍(lán)紫色，G-菌體呈淺紅色。通過(guò)革蘭氏染色法可把所有細(xì)菌分兩在類。因此它是分類鑒定菌種的重要指標(biāo)。其染色機(jī)制：通過(guò)初染和媒染操作后，在細(xì)菌細(xì)胞的膜或原生質(zhì)體上染上了不溶于水的結(jié) 晶紫與碘的大分子復(fù)合物。革蘭氏染色陽(yáng)性（蘭氏染色陽(yáng)性（Gram Positive）:革蘭氏陽(yáng)性菌由于細(xì)胞壁厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊 密，故在用乙醇洗脫時(shí)，肽聚糖網(wǎng)孔會(huì)因脫水而明顯收縮，再加上它基本不含類脂，故用乙醇處理不能在壁上溶出縫隙，