疾控中心檢驗(yàn)科沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)

1、疾控中心檢驗(yàn)科沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)1. 目的：保證CT DNA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。2. 適用范圍：CT DNA的 TaqMan熒光定量檢測(cè)，標(biāo)本類(lèi)型為分泌物。3 負(fù)責(zé)人： 操作人：4. 原理： 本試劑盒用一對(duì)沙眼衣原體特異引物和一條沙眼衣原體特異性熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核苷酸 單體（dNTPS等成分，再用 PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)沙眼衣原體 DNA5. 性能參數(shù)：檢出低值v 25基因拷貝/ml。6. 標(biāo)本要求：（ 1 ）標(biāo)本類(lèi)型： 分泌物。（ 2）標(biāo)本采集： 見(jiàn)標(biāo)本采集手冊(cè)。（3）標(biāo)本儲(chǔ)存和運(yùn)輸：室溫放置不超過(guò) 8小時(shí)，4-8 C不超過(guò)72 小時(shí)，-20

2、C保存期6個(gè)月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫運(yùn)輸。（ 4）標(biāo)本拒收狀態(tài)： 細(xì)菌污染標(biāo)本不能作測(cè)定。7. 容器和添加劑類(lèi)型： 無(wú)菌離心管和無(wú)菌試管。8. 所需設(shè)備： ABI GeneAmp 5700、臺(tái)式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4C、-20 C）、生物安全柜、紫外燈9. 試劑：DNA提取液（500卩1/管）2管；CT-PCR反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管）20管；陽(yáng)性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1 X 108基因拷貝/ml ） （50卩1/ 管）1管；陰性質(zhì)控品（250卩1/管）1管。10. 校準(zhǔn)程序（計(jì)量學(xué)溯源性）：送XXX市計(jì)量檢測(cè)所校準(zhǔn)。11 程序步驟 :：11.1 標(biāo)本采集、保存和運(yùn)送男性：取尿道分泌物或細(xì)小棉拭子伸

3、入快尿道約24cm略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜） 。將分泌物或棉拭子置入無(wú)菌玻璃管，用無(wú) 菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。女性：陰道用無(wú)菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物，再用無(wú)菌 棉拭子插入宮頸內(nèi)，停 5 秒鐘后旋動(dòng)棉拭采取宮頸分泌物，將棉拭子置 入無(wú)菌玻璃管，用無(wú)菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。尿道用無(wú)菌生理鹽水棉球洗凈尿道口，再用無(wú)菌棉拭子插入尿道約2cm,略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將棉拭子置入無(wú)菌玻璃 管，用無(wú)菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可保存于-20 C待測(cè)，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 0 C冰壺。11.2 標(biāo)本及對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的處理標(biāo)本試管中加入 1ml

4、無(wú)菌生理鹽水,充分震蕩搖勻,吸取液體轉(zhuǎn)至 1.5ml 離心管中 （如分泌物較多, 只取 0.2ml ） 12000rpm 離心 5 分鐘 .沉淀加無(wú)菌生理鹽水1ml打勻，12000rpm離心5分鐘,再重復(fù)洗滌一次沉淀直接加50ulDNA提取液充分混勻，（提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì),取 樣時(shí)需用加樣器充分混勻后吸取。 如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取 樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無(wú)污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。 ） 沸水浴10分鐘（誤差不超過(guò)1分鐘），轉(zhuǎn)至4C靜置6-8小時(shí)以保證充 分裂解。12, OOOrpm離心2分鐘，取上清液2ul做PCR反應(yīng)。另取陰陽(yáng) 性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品各50ul加等量DNA提

5、取液打勻，沸水浴10分鐘后同上處 理。11.3GeneAmp5700操作取單管單人份 PCR反應(yīng)管若干管，直接加入處理后樣品（或陰陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品）2ul , 6000rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入 PCR儀，按下 列條件擴(kuò)增：ABI GeneAmp570（的循環(huán)條件：93C 2分鐘預(yù)變性，然后按 93C 45秒55 C 60秒，先做10個(gè)循環(huán)，最后93 C 30秒55 C 45秒，做30 個(gè)循環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運(yùn)行程序。11.4 結(jié)果分析條件的設(shè)定ABI GeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根 據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) baseline 的 start 值

6、（24）,stop 值（79） 以及 Threshold 值, 使陰性質(zhì)控品 Ct 值為 30, 臨界陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 Ct 值為 2224,強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品 Ct值為1820,最后記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出 的 Ct 值.12 質(zhì)量控制程序：陰性質(zhì)控品：全部陰性 陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽(yáng)性I r | 三 0.97（correlation 數(shù)值介于-0.97-1）; 108 至 104 基因拷貝/ml的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的定量值與理論值相比誤差小于土300%13 干擾： 標(biāo)本污染。14 生物參考區(qū)間： 正常人樣本為陰性或 0 基因拷貝 /ml 。15. 患者檢驗(yàn)結(jié)果的可報(bào)告區(qū)間：Ct值40,實(shí)驗(yàn)樣本的CT DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml ） =M Ct值=40,樣品CT DNA含量25基因拷貝