微生物實驗指導

1、實驗一 微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基是將微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質，用人工方法配制而成的各種營養(yǎng)基質。它具有微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料和適宜的環(huán)境條件：(1)適當組分和比例的營養(yǎng)物質；(2)適宜的pH值；(3)合適的滲透壓；(4)保持無菌狀態(tài)。所以培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物所必需的最主要材料。培養(yǎng)基的配制是微生物工作者的主要技術操作之一。一、實驗目的與耍求： 1了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。 2了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。3熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關準備工作及操作方法。二、實驗原理與材料： (一) 培養(yǎng)基的種類 根據(jù)培養(yǎng)基的組成成分，

2、可將培養(yǎng)基分為三類：合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質按一定比例配制而成。 半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。 天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成的。 從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分： 液體培養(yǎng)基：不加凝固劑。 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加2左右的凝固劑。 半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2一0.5凝固劑。 微生物最常用的凝固劑為瓊脂(其次為明膠)，又叫洋菜、凍粉。它不是一種營養(yǎng)物質，只能被極少數(shù)種類的細菌分解利用。瓊脂是從海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一種多糖類化合物，主要成分是復雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規(guī)濃度下加熱到96以上即成溶膠狀態(tài)，

3、融化的瓊脂，當溫度下降到42以下，又凝固為固體。 表3-1 瓊脂與明膠特性比較 比較項目 瓊 脂 明 膠比較項目瓊 脂明 膠 熔點() 凝固點() 酸堿度 灰 分() 氧化鈣() 氯化鎂() 氮() 96 40 微酸 16.0 1.15 O.77 O.40 25 20 酸性 14.015.0 0.0 0.0 18.3微生物可利用性耐熱性來 源化學本質常用濃度（)絕大多數(shù)微生物不能水解利用強植物多糖1.52部分微生物能水解利用弱動物蛋白質5一12（二）實驗材料 1藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂；馬鈴薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KN03，MgS04·7H20、FeSO4

4、83;7H20、等。 2高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細菌過濾器、紫外線殺菌。3其它：天平、牛角匙、電爐、1N HCl、1N NaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無菌試管、無棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標簽等。三、實驗方法與步驟：(一)、培養(yǎng)基的配置 1培養(yǎng)基的配制常用方法和步驟： (1)稱量：按照培養(yǎng)基配方，正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。 (2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根據(jù)實驗需要加入蒸餾水或自來水)，用玻棒攪勻，加熱溶解。 (3)調pH值(調pH也可以在加瓊脂后再調)，用1N NaOH或1N HCl調p

5、H，用pH試紙對照。 (4)加瓊脂熔化，在瓊脂熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全熔化后，補足所失水分，一般數(shù)量少，時間短不必補水。 (5)分裝：在漏斗架上分裝。根據(jù)不同的需要進行分裝，一般制斜面的裝量為管高的五分之一。 特別注意不要使培養(yǎng)基粘污在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。 (6)包扎成捆、掛上標簽。培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆，掛上所配培養(yǎng)基名稱的標簽。 (7)滅菌備用。滅菌后如需制成斜面的，應在下磅后取出，擺成斜面，(見圖3一1)。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，如確無菌生長，方可使用。 2三種培養(yǎng)基的配方及配制 （

6、1）.牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(用于分離和培養(yǎng)細菌，是一種天然培養(yǎng)基)。 配方： 牛肉膏 3克 蛋白胨 5克 氯化鈉 3克 瓊脂 20克 自來水 1000毫升 pH 7274 滅菌 15磅英寸2，30分鐘。 本實驗將原配方配成各種濃縮液。各種濃度如下：30牛肉膏、50蛋白胨，30氯化鈉。以配制200毫升培養(yǎng)基為例： 吸取30牛肉膏2毫升，50蛋白胨2毫升，30氯化鈉2毫升，加入有刻度的搪瓷燒杯中，然后用自來水補足到200毫升。用玻捧攪勻，在電爐上稍加熱，調pH至7.4，加瓊脂4克，加熱熔化，用玻棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解為止，趁熱在漏斗架上裝試管，(見圖32)。裝帶有棉塞的無菌試管，裝置五分之一

7、的試管高度共12支，作斜面培養(yǎng)基。用鋁殼試管帽的各裝10毫升，約試管高度的二分之一以上，用作分離時倒平板用。 分裝完畢，以12支為一捆，用防水紙包扎成捆，(圖33)掛上標簽，滅菌備用。 （2）馬鈴薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)瓊脂培養(yǎng)基。(用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基)。 配方：去皮馬鈴薯(或鮮豆芽) 200克 蔗糖(或葡萄糖) 20克 自來水 1000毫升 瓊脂 20克 pH 自然 滅菌：(含蔗糖)15磅英寸2 30分鐘。 (含葡萄糖)10磅英寸220分鐘。 制備方法：配制200毫升培養(yǎng)基。 取去皮馬鈴薯40克，切成小塊，放入無刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置電爐上加熱，煮沸

8、十分鐘，用四層紗布過濾至具刻度的搪瓷杯中，濾液加水補足至200毫升，然后加蔗糖4克，加瓊脂4克，加熱熔化，并用玻棒不斷攪拌，直至瓊脂完全熔化，分裝試管，下面一系例步驟同配細菌培養(yǎng)基相同。 （3） 淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏一號GauseS1)，用于分離和培養(yǎng)放線菌之用，是一種合成培養(yǎng)基。 配方：可溶性淀粉 20.O克 KN03 1.0克 K2HP04 O.5克 MgS04·7H20 O.5克 NaCl O.5克 FeS04·7H20， O.01克 瓊脂 20克 自來水 1000毫升 滅菌：15磅英寸2，30分鐘。 制備方法：配制200毫升培養(yǎng)基 吸取配方液：1 KN03 20毫升

9、；l K2HP04 lO毫升；l MgSO4·7H2O lO毫升；lNaCl 10毫升；1FeSO4·7H2O O.2毫升，加水補足至200毫升，置電爐上加熱。用另一只搪瓷杯稱取可溶性淀粉4克，從200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒調成糊狀，待液體沸騰后，將淀粉糊洗入培養(yǎng)液中，攪勻，取下調pH至7.4，加瓊脂4克，加熱至瓊脂完全熔化為止，趁熱分裝試管，下面一系例步驟同于配制細菌培養(yǎng)基的操作方法。 （4）無菌水的制備： 無菌水，為下一次微生物分離實驗中所需用的材料。100毫升三角瓶(裝有玻璃珠)，裝自來水45毫升，試管中裝9毫升自來水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角瓶和試管

10、須預先塞好棉塞，并經(jīng)干熱滅菌。 (二)分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準備 1清洗一些玻璃儀器：如三角瓶，試管，培養(yǎng)皿、吸管等。 2棉塞的制作：裝培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用為過濾空氣，使試管內外空氣可以流通，但外界空氣中雜菌不能進入，避免污染。試管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口約l2毫米處，用解剖針塞入少許棉花，(約11.5厘米長)，以防止細菌吸入口中，并避免將口中細菌吹入管內。棉花要塞得松緊適宜。吹時以能通氣但不使棉花滑下為準。 教師示范做試管棉塞，同學每人做5支試管棉塞。棉塞要求不緊不松，兩頭光滑，試管棉塞的長度約3厘米左右。塞入試管內部分約占23

11、，頭部稍大約占l/3左右，見圖34。1 2 3 4 5 .圖3-4 棉塞的要求條件1.正確的式樣 2.管內部太短，管外太松 3.管外太小 4.整個棉塞過松 5. 管內部太緊，管外太松3包裝培養(yǎng)皿和吸管等。為了使培養(yǎng)皿、吸管，三角玻棒等洗凈，干熱滅菌后，不讓表面暴露，以保證無菌狀態(tài)，為此干熱滅菌前先用舊報紙包裝妥當(見示范)，每組同學包培養(yǎng)皿6只(一包)。 吸管的包裝，將塞好棉花的吸管尖端，放在45厘米寬的長紙條的一端，約成45º角，折疊紙條，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌。見圖35。 (三)培養(yǎng)

12、基和玻璃器材的滅菌方法 滅菌的方法，通?？梢苑譃樗拇箢悾?1)加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；(2)過濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；(4)化學藥劑滅菌和消毒。在本實驗中，以介紹與培養(yǎng)基和玻璃器材滅菌有關的部份滅菌方法。 1干熱滅菌法(即熱空氣滅菌法)： 干熱滅菌般是利用電熱烘箱作為干熱滅菌器。前面所包裝好的玻璃器皿，如帶棉塞的三角瓶，試管、包裝好的吸管、培養(yǎng)皿等 蛋白質含水量(%) 凝固溫度() 50 25 18 6 O 56 7480 8090 145 160一170，放入電熱烘箱中。 打開烘箱頂部的通氣孔，接上電源加熱，使箱內空氣的溫度達到160一1

13、70，關閉通氣孔，使箱內的溫度保持在160左右，并維持1.52小時。時間一到，切斷電源。待溫度下降至60一70以下，方可打開箱門取滅菌物品，否則驟冷后易使箱內玻璃儀器破損。 2加壓蒸汽滅菌法 利用高壓滅菌器，使水的沸點在密閉的滅菌器內隨壓力升高而增高(見表32)，來提高蒸汽的溫度和滅菌的效率。表3-2 加壓蒸汽滅菌器壓力數(shù)與蒸汽溫度間的關系壓力表所示壓力全部水蒸汽(無空氣)50空氣全部空氣 磅英寸2 公斤厘米2 5 10 15 20 O.35 0.7 1.05 1.4l 108 115 121 126 94 105 112 118 72 90 100 109 在同一溫度下，濕熱的殺菌效率比干熱

14、大，因為微生物細胞蛋白質在濕熱情況下，易于凝固，(見表62)。同時濕熱的穿透力強，當水蒸汽與被滅菌的物品相接觸后，便放出汽化潛熱，逐步提高被滅菌物品的溫度，直至與水蒸汽的溫度相等，達到平衡為止,從而提高滅菌效率。 手提式高壓滅菌鍋滅菌的操作步驟如下： (1)在滅菌器內加入一定量的水(有的滅菌器內加水至止水線)。將用防水紙包扎好的滅菌物品如:培養(yǎng)基、無菌水等，放進滅菌器內。 (2)接通電源，進行加熱。 (3)當壓力到達5磅英寸2時，打開放氣閥，使鍋內的空氣和水蒸汽一同排出，直至壓力表的壓力恢復到零，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱。 (4)當壓力表上的壓力到達15磅英寸2(即1.05公斤平方厘米)時，此

15、時滅菌器內的溫度達到121，維持30分鐘不變。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基滅菌時，應適當降低壓力，延長時間。 (5)滅菌時間一到，切斷電源，待壓力下降至零時，才能打開排氣孔，然后打開滅菌器蓋，取出物品。 如果滅菌后的固體培養(yǎng)基要做成斜面,需趁熱放置。還需檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。 3間歇滅菌法： 常采用阿諾(Arnold)氏滅菌器和柯赫(Koch)氏滅菌器或蒸籠滅菌，常壓條件下，蒸汽溫度不超過100度。在沒有高壓滅菌器設備的情況下或不宜加壓滅菌的物品，可采用此法滅菌。 做法是：待滅菌物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮一次，每次煮沸一小時，連續(xù)三天重復進行。在每兩次蒸煮之間，將物品(指培養(yǎng)基)放在37恒溫條件

16、下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以使下一次蒸煮時殺滅。 4過濾除菌法： 一些不能加熱滅菌的液體物質(如維生素、血清)，可以用過濾除菌法，一般用細菌過濾器進行除菌。(教師示范) 細菌過濾器中的過濾板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，過濾板孔眼很小，細菌不能通去。因此，過濾后的液體就除去了細菌。在進行過濾除菌前，整個細菌過濾器和接受液體的器皿，必須包裝妥當進行加壓蒸汽滅菌后方可使用。 5紫外線滅菌： 波長2600一2800 A(A=110nm)之間的紫外線有很強的殺菌能力，一般紫外燈管能產(chǎn)生2537A的紫外光，殺死力強而穩(wěn)定，但穿透力弱，一般只適宜物體表面、空氣滅菌。例如

17、接種室、培養(yǎng)室、手術室、藥廠包裝室等空氣滅菌。一般30瓦燈管，9立方米空間，距地面2米，每次打開紫外線照射半小時，就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時，先噴灑石碳酸等化學消毒劑，可增強滅菌效果。 在進行微生物接種和分離等操作時，常須用紫外線來殺滅接種室(箱)空氣、臺面等處的微生物。(參觀示范) 紫外線雖有較強的殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。表34 常用化學抑茵劑和殺毒劑 類別 代表 常用濃度 作用方式 用途及用法醇類乙醇7075抑制細菌使蛋白質凝固變性皮膚和器皿消毒對芽孢孢子無效醛類甲醛37402毫升米3與蛋白質胺基結合使其變性接中寶、

18、接中箱熏蒸，殺死空氣中微生物酚類石炭酸來蘇兒5 25破壞細胞膜，蛋白質變性接中室空氣及器皿消毒空氣及皮膚消毒重金屬離子 升汞 O.1 細菌細胞酶失活而中毒死亡 植物組織，如根瘤的消毒(有劇毒)氧化劑高錳酸鉀漂白粉0.131一5蛋白質及酶氧化變性水果、皮膚、器皿消毒飲水及糞便消毒表面活性劑肥皂新潔爾滅 水稀20倍破壞細胞膜的滲透壓 皮膚、手及器血的消毒 鹵素 碘 l碘酒 蛋白質、酶受破壞 皮膚消毒染料結晶紫24水溶液抑制細胞壁的合成作用皮膚創(chuàng)傷消毒酸類乳酸食醋80乳酸l毫升米335毫升米3與細胞原生質結合熏蒸消毒空氣，可預防流感病毒 堿類 石灰水 35水溶液 破環(huán)酶的活性 地面消毒 紫外線對眼粘

19、膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，所以不能直接在紫外線燈開啟下工作。 6化學藥劑消毒滅菌： 微生物實驗室中常用的化學殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑。具體見表64。 四、實驗注意事項1 使用高壓蒸汽鍋時應加充足水分，以免蒸干。鍋內的冷空氣要排盡，否則壓力雖達要求，而溫度未達到要求，滅菌不完全。2 每次使用干熱滅菌箱時，要滅菌的玻璃器皿，必須完全干燥，以免引起玻璃的破裂。調節(jié)溫度不能高于180，否則會使棉花、紙張烤焦。滅菌后，需等溫度下降到l 60以下，才能打開箱門，否則易使玻璃因驟冷而破裂。凡橡皮塞或橡

20、皮管不能用干熱滅菌，因高溫會使橡皮破壞。3 在使用過濾器前應檢查過濾器有無裂隙及漏氣，濾器用后應立即清洗。五、實驗記錄六、實驗數(shù)據(jù)處理 七、思考題1 配制培養(yǎng)基為什么要調節(jié)pH值？2 培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么? 配固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意那些問題?3 為什么牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基不加礦物鹽類？4 配制培養(yǎng)基要注意哪些問題？可否用橡皮塞、木塞來代替棉花塞？5 干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌應用的的場合有何不同?6 如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?I環(huán)境中的微生物因為微生物是肉眼看不見的，所以初學微生物學的學生常不知道外界環(huán)境和所有與外界接觸的身體各部位均有微生物的存在。實際上它們廣泛分布于

21、室內外的空氣、水和土壤中，桌、椅和板凳的表面，衣服以及身體的皮膚、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉頭等的粘膜）等處，因此，可以說微生物是無縫不鉆，無孔不入的。在學生第一次進入微生物學實驗室時，建立起“微生物無所不在”這一概念是特別重要的，因為這樣才能體會到無菌技術和環(huán)境衛(wèi)生的必要性，才能防止外界微生物對培養(yǎng)物的污染，才能防止病原性細菌或病毒通過手或衣服進入人體而引起傳染。從周圍環(huán)境和體表各部取樣生長出來的微生物，雖然大多數(shù)屬正常菌群，但當進入破損的皮膚或傳入口內或眼睛等處也會引起傳染，這一方面是因為通過培養(yǎng)，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但當條件改變時也可能致?。ǚQ為條件致

22、病菌），因此必須詳細閱讀操作步驟和聽從指導者的說明，特別是用過的棉簽和工作完畢后的培養(yǎng)物等均要放在指定的容器內，接種環(huán)不僅在用前必須燒灼滅菌，而且用后也應立即燒灼。這是整個微生物學實驗課程和今后進行微生物學實驗時均需注意的。下面的實驗就是從實驗室空氣、實驗臺、門的旋扭（或把手）和人的頭發(fā)、皮膚、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等處取樣，接種于瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)12天后，觀察并比較不同來源的微生物生長的數(shù)量和類型。實驗二 實驗室環(huán)境和人體表面微生物的檢查一、目的要求1證明實驗室環(huán)境與體表存在微生物。2比較來自不同場所與不同條件下細菌的數(shù)量和類型。3體會無菌操作的重要性。二、基本原理平板培養(yǎng)基含有細菌生長

23、所需要的營養(yǎng)成分，當取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在37溫度下培養(yǎng)，12天內每一菌體即能通過很多次細胞分裂而進行繁殖，形成一個可見的細胞群體的集落，稱為菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質地疏松或緊密等。因此，可通過平板培養(yǎng)來檢查環(huán)境中細菌的數(shù)量和類型。三、器材肉膏蛋白胨瓊脂平板，無菌水，滅菌棉簽（裝在試管內），接種環(huán)，試管架，酒精燈或煤氣燈，記號筆（或蠟筆），廢物缸。四、操作步驟每組在“實驗室”和“人體”兩大部分中各選擇一個內容做實驗，或由教師指定分配，最后結果供全班討

24、論。1寫標簽任何一個實驗，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號，培養(yǎng)皿的記號一般寫在皿底上。如果寫在皿蓋上，同時觀察兩個以上培養(yǎng)皿的結果，打開皿蓋時，容易混淆。用記號筆寫上班級、姓名、日期，本次實驗還要寫上樣品來源（如實驗室空氣或無菌室空氣或頭發(fā)等），字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當中，以免影響觀察結果。2實驗室細菌檢查（1）空氣 將一個肉膏蛋白胨瓊脂平板放在當時做實驗的實驗室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無菌室或無人走動的其他實驗室，移去皿蓋。一小時后蓋上兩個皿蓋。（2）實驗臺和門的旋鈕（a）用記號筆在皿底外面中央畫一直線，再在此線中間處畫

25、一垂直線，如圖。（b）取棉簽 左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無名指夾持棉塞（或試管帽），將其取出，將管口很快地通過煤氣燈（或酒精燈）的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出。放回棉塞（或試管帽），并將空試管放在試管架上。（c）弄濕棉簽 左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞（或試管帽）并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞（或試管帽），并將滅菌水試管放在試管架上。（d）取樣 將濕棉簽在實驗臺面或門旋鈕上擦拭約2平方厘米的范圍。（e）接種 在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成

26、一縫。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動一下），立即閉合皿蓋。將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或試管帽），燒灼管口，插入用過的棉簽，將試管放回試管架。（f）劃線 另取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來回通過火焰數(shù)次。左手拿起平板，同樣開啟一縫，將滅過菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半處。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動的壓力不能太大，否則會刺破瓊脂。

27、閉合皿蓋，左手將平板向左轉動至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接種環(huán)通過前面劃的線條再在瓊脂的另一半，從上向下來回劃線至12處。燒灼接種環(huán)，轉動平板，劃最后14，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回原處。整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。3人體細菌的檢查（1）手指（洗手前與洗手后）（a）分別在兩個瓊脂平板上標明洗手前與洗手后（當然，班級、姓名、日期各項在每次寫標簽時是必不可少的）。（b）移去皿蓋，將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來回移動，蓋上皿蓋。（2）頭發(fā) 在揭開皿蓋

28、的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動數(shù)次，使細菌降落到瓊脂平板表面，然后蓋上皿蓋。（3）咳嗽 將去蓋瓊脂平板放在離口約68cm處，對著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上皿蓋。（4）鼻腔（a）按照實驗臺檢查法的步驟（b）和（c），取出棉簽，并將其弄濕。（b）用濕棉簽在鼻腔內滾動數(shù)次。（c）按實驗臺檢查法的步驟（e）和（f），接種與劃線，然后蓋上皿蓋。4將所有的瓊脂平板翻轉，使皿底在上，放37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12天。5結果記錄方法（1）菌落計數(shù)在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內的菌落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。（2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不

29、同的菌落類型。但要注意，如果細菌數(shù)量太多，會使很多菌落生長在一起，或者限制了菌落生長而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點時，要選擇分離得很開的單個菌落。菌落特征描寫方法如下：（a）大小 大、中、小、針尖狀。可先將整個平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標準，或由教師指出一個大小范圍。（b）顏色 黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。（c）干濕情況 干燥、濕潤、粘稠。（d）形態(tài) 圓形、不規(guī)則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。（f）透明程度 透明、半透明、不透明。（g）邊緣 整齊、不整齊。五、實驗報告1結果（1）將你自己的平板結果記錄于下表中。（2）與其他同學所做的結果進行比較

30、。2思考題（1）比較各種來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？（2）人多的實驗室與無菌室（或無人走動的實驗室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？（3）洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無區(qū)別？（4）通過本次實驗，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細菌的擴散方面，你學到些什么？有什么體會？實驗三 顯微鏡油鏡的使用和細菌形態(tài)的觀察 微生物的個體微小，肉眼難以見到，要研究它們，必須要用顯微鏡來觀察。因此，顯微鏡是研究微生物的重要工具。顯微鏡是一種精密的光學儀器，使用時必須了解其基本原理和構造，才能充分發(fā)揮其性能。一、實驗目的和要求： 1學習并掌握顯微鏡油鏡的使用

31、技術及維護的基本知識。 2使用油鏡觀察細菌的幾種基本形態(tài)。 3用懸滴法在高倍鏡或油鏡下觀察細菌的運動。 二、實驗裝置與材料：（一）光學顯徽鏡 1顯微鏡的構造 普通光學顯微鏡可分為兩大部份：光學部分和機械部分。光學部分通常是由接目鏡、接物鏡和照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)組成的。它使檢視物放大，造成物象，是顯微鏡的重要組成部份。機械部分由鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、載物臺移器、粗調節(jié)器、細調節(jié)器等部件組成，它起著支持、調節(jié)、固定等作用。 2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 (1)顯微鏡的放大倍數(shù) 顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過物鏡第一次放大造像，再經(jīng)過目鏡在明視距離內第二次放造像。因此，顯微

32、鏡的放大倍數(shù)等于接物鏡放大倍數(shù)和接目鏡放大倍數(shù)的乘積。即： 顯微鏡放大倍數(shù) = 接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)。 (2)顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體(兩端)兩點之間距離的能力，能夠辨析物體兩點問的距離愈小，則分辨率愈高，分辨率的高低，首先取決于物鏡的鏡口率所使用光線的波長，見圖(12) 顯微鏡的分辨率可以用以下公式表示： 式中D：為物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。 ：為可見光的波長(平均O.55微米)。 n :為物鏡和被檢標本間介質的折射率。 :為鏡口角(即入射角)。愈大，D值愈大，分辨率愈低，n和愈大，D值愈小，分辨率愈高，因此，可以通過降低光線波長，增大介質折

33、射率和加大鏡口角(入射角)來提高分辨率。 3油鏡使用的原理： 對于個體微小，用高倍鏡仍觀察不清的微生物，則必須使用油鏡。使用時，需要在標本和物鏡間加入一種鏡頭油。如香柏油，所以叫油浸接物鏡，簡稱油鏡。一般在鏡頭上有一黑圈或紅圈的，表示為油鏡物鏡，也有的以“OI”或”HI”字樣來表示。由于油鏡鏡面很小，使用時檢視物與鏡面又非?？拷?O.14一O.19毫米左右)，因而使進入鏡頭的光線較少。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭間的空氣時，由于玻片與物鏡之間的介質為空氣(接物鏡干燥系)，空氣折射率為l，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射現(xiàn)象，結果進入物鏡的光線必然減少，這樣就降低了視野的照明度

34、。若載玻片與物鏡之間的介質不是空氣，而是一層油質，一般常用香柏油，其折射率為1.515，與玻璃的折射率(1.52)相近。光線通過載玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而幾乎不發(fā)生折射(接物鏡油浸系)，使視野增加照明度，這樣就能使物像更加清晰；(二)、實驗材料 1顯微鏡，(顯微鏡燈)、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。 2細菌的染色標本。 3培養(yǎng)1218小時的枯草桿菌(B.Subtilis) 4蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。三、實驗方法與步驟 (一) 顯微鏡的使用方法與步驟 1用前檢查：從顯微鏡箱中取出顯微鏡時，用右手拿鏡臂，左手托鏡座，直立移動，輕放在平穩(wěn)的桌面上，檢查各部零件是否齊全，鏡頭是否清

35、潔，否則報告老師。 2調節(jié)光照：正確的照明是獲得良好檢查效果的前提。用粗調節(jié)器提升鏡筒，將低倍物鏡旋到鏡筒下方，使鏡頭和載物臺距離約為5毫米左右，左眼看目鏡調節(jié)反光鏡鏡面角度(在天然的光線下觀察，一般用平面反光鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡)。調節(jié)光線強弱，然后調節(jié)聚光鏡的位置(酌予升降)，直至視野內得到最均勻最適宜的光亮為止。 3低倍鏡觀察：低倍物鏡視野面廣，焦點深度較深，易于發(fā)現(xiàn)目標確定觀察位置，故應先用低倍鏡觀察為宜。 將載片標本(涂面朝上)置于載物臺的標本夾上，并將標本部位處于物鏡的正下方，轉動粗調節(jié)器，使鏡頭下降至鏡面距離檢視物大約10毫米處。然后以左眼看目鏡，另一眼睜開，

36、一邊觀察視野，一邊扭動粗調節(jié)器使鏡頭緩慢地升高，至視野內出現(xiàn)物像后，改用細調節(jié)器，上下微微轉動，仔細調節(jié)焦距和照明，直至視野內獲得清晰的物像，選擇適宜部位，移到視野中心，待換中、高倍鏡觀察。 4依次再進行中倍、高倍觀察。在物鏡依次由低倍至中倍、高倍的觀察過程中，應逐次上升聚光鏡以調節(jié)光線亮度，同樣選擇適宜的部位移至視野中央。 5油鏡觀察：將聚光鏡提升至最高點，轉動轉換器，移開高倍鏡，使高倍鏡和油鏡成“八”字形，在標本中央滴一小滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，微微轉動細調節(jié)器，可見清晰物像，如果油鏡上升已離開由面還未看清物像的話，需重新調節(jié)。此時可從側面注視，用粗調節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡

37、浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標本相接。應特別注意不能壓在標本上，更不能用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。用右手向上轉動粗調節(jié)器，當視野中有模糊的標本物像時，改用細調節(jié)器，直到看清物象為止。 6換片：另換新的標本片，必須從第三條開始操作。7用后復原：觀察完畢，上旋鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去鏡頭上的殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。機械部件用細軟布擦去灰塵和冷凝水，下降鏡筒，將接物鏡轉成八字形置于載物臺上。下降聚光鏡，(切勿使接物鏡與聚光鏡相碰受損)，反光鏡垂直于鏡座。放進顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的顯微鏡柜中。四、實驗注意事

38、項顯微鏡顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項： (1)不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件，以免損壞。 (2)鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布擦，以保證鏡面的光潔度。 (3)觀察標本時，必須依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可用粗調節(jié)器向下旋，以免物鏡碰到玻片損傷鏡面或壓碎玻片。 (4)觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習慣，。以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。 (5)拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿動。(6)顯微鏡應存放在陰涼干燥處，以免鏡片生霉菌而腐蝕鏡片。(7)在轉動粗細調節(jié)器調節(jié)焦距時，要從側面觀察，切勿使物鏡鏡頭與玻片相碰，以免損壞鏡頭。(8)在觀察細菌、放線菌的形態(tài)時，由于采用油鏡頭透鏡口徑較小，所以光線要調到最強，便于觀察。 五、實驗記錄六、實驗數(shù)據(jù)處理七、思考題1. 如何區(qū)別顯微鏡的低倍鏡、高倍鏡和油鏡？2. 使用油鏡時，為何必須鏡頭油？3. 鏡檢標本時，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？實驗四 顯微鏡直接計數(shù)法一、目的要求1明確顯微鏡計數(shù)的原理。2學習使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。二、基本原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種