微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、實(shí)驗(yàn)一 微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌培養(yǎng)基是將微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的各種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。它具有微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料和適宜的環(huán)境條件：(1)適當(dāng)組分和比例的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；(2)適宜的pH值；(3)合適的滲透壓；(4)保持無(wú)菌狀態(tài)。所以培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物所必需的最主要材料。培養(yǎng)基的配制是微生物工作者的主要技術(shù)操作之一。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c耍求： 1了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過(guò)程。 2了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。3熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理與材料： (一) 培養(yǎng)基的種類(lèi) 根據(jù)培養(yǎng)基的組成成分，

2、可將培養(yǎng)基分為三類(lèi)：合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。 半合成培養(yǎng)基：由一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。 天然培養(yǎng)基：利用天然來(lái)源的有機(jī)物配制而成的。 從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來(lái)分： 液體培養(yǎng)基：不加凝固劑。 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加2左右的凝固劑。 半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2一0.5凝固劑。 微生物最常用的凝固劑為瓊脂(其次為明膠)，又叫洋菜、凍粉。它不是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，只能被極少數(shù)種類(lèi)的細(xì)菌分解利用。瓊脂是從海藻中(主要是石花菜)提取而制成的。是一種多糖類(lèi)化合物，主要成分是復(fù)雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規(guī)濃度下加熱到96以上即成溶膠狀態(tài)，

3、融化的瓊脂，當(dāng)溫度下降到42以下，又凝固為固體。 表3-1 瓊脂與明膠特性比較 比較項(xiàng)目 瓊 脂 明 膠比較項(xiàng)目瓊 脂明 膠 熔點(diǎn)() 凝固點(diǎn)() 酸堿度 灰 分() 氧化鈣() 氯化鎂() 氮() 96 40 微酸 16.0 1.15 O.77 O.40 25 20 酸性 14.015.0 0.0 0.0 18.3微生物可利用性耐熱性來(lái) 源化學(xué)本質(zhì)常用濃度（)絕大多數(shù)微生物不能水解利用強(qiáng)植物多糖1.52部分微生物能水解利用弱動(dòng)物蛋白質(zhì)5一12（二）實(shí)驗(yàn)材料 1藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂；馬鈴薯，蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KN03，MgS04·7H20、FeSO4

4、83;7H20、等。 2高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細(xì)菌過(guò)濾器、紫外線殺菌。3其它：天平、牛角匙、電爐、1N HCl、1N NaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無(wú)菌試管、無(wú)棉塞的空試管、培養(yǎng)皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標(biāo)簽等。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟：(一)、培養(yǎng)基的配置 1培養(yǎng)基的配制常用方法和步驟： (1)稱(chēng)量：按照培養(yǎng)基配方，正確稱(chēng)取各種原料放于搪瓷杯中。 (2)溶化：在搪瓷杯中加入所需水量(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入蒸餾水或自來(lái)水)，用玻棒攪勻，加熱溶解。 (3)調(diào)pH值(調(diào)pH也可以在加瓊脂后再調(diào))，用1N NaOH或1N HCl調(diào)p

5、H，用pH試紙對(duì)照。 (4)加瓊脂熔化，在瓊脂熔化過(guò)程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦，待完全熔化后，補(bǔ)足所失水分，一般數(shù)量少，時(shí)間短不必補(bǔ)水。 (5)分裝：在漏斗架上分裝。根據(jù)不同的需要進(jìn)行分裝，一般制斜面的裝量為管高的五分之一。 特別注意不要使培養(yǎng)基粘污在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。 (6)包扎成捆、掛上標(biāo)簽。培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆，掛上所配培養(yǎng)基名稱(chēng)的標(biāo)簽。 (7)滅菌備用。滅菌后如需制成斜面的，應(yīng)在下磅后取出，擺成斜面，(見(jiàn)圖3一1)。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，如確無(wú)菌生長(zhǎng)，方可使用。 2三種培養(yǎng)基的配方及配制 （

6、1）.牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌，是一種天然培養(yǎng)基)。 配方： 牛肉膏 3克 蛋白胨 5克 氯化鈉 3克 瓊脂 20克 自來(lái)水 1000毫升 pH 7274 滅菌 15磅英寸2，30分鐘。 本實(shí)驗(yàn)將原配方配成各種濃縮液。各種濃度如下：30牛肉膏、50蛋白胨，30氯化鈉。以配制200毫升培養(yǎng)基為例： 吸取30牛肉膏2毫升，50蛋白胨2毫升，30氯化鈉2毫升，加入有刻度的搪瓷燒杯中，然后用自來(lái)水補(bǔ)足到200毫升。用玻捧攪勻，在電爐上稍加熱，調(diào)pH至7.4，加瓊脂4克，加熱熔化，用玻棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解為止，趁熱在漏斗架上裝試管，(見(jiàn)圖32)。裝帶有棉塞的無(wú)菌試管，裝置五分之一

7、的試管高度共12支，作斜面培養(yǎng)基。用鋁殼試管帽的各裝10毫升，約試管高度的二分之一以上，用作分離時(shí)倒平板用。 分裝完畢，以12支為一捆，用防水紙包扎成捆，(圖33)掛上標(biāo)簽，滅菌備用。 （2）馬鈴薯(或豆芽汁)蔗糖(或葡萄糖)瓊脂培養(yǎng)基。(用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基)。 配方：去皮馬鈴薯(或鮮豆芽) 200克 蔗糖(或葡萄糖) 20克 自來(lái)水 1000毫升 瓊脂 20克 pH 自然 滅菌：(含蔗糖)15磅英寸2 30分鐘。 (含葡萄糖)10磅英寸220分鐘。 制備方法：配制200毫升培養(yǎng)基。 取去皮馬鈴薯40克，切成小塊，放入無(wú)刻度的搪瓷杯中，加水200毫升，置電爐上加熱，煮沸

8、十分鐘，用四層紗布過(guò)濾至具刻度的搪瓷杯中，濾液加水補(bǔ)足至200毫升，然后加蔗糖4克，加瓊脂4克，加熱熔化，并用玻棒不斷攪拌，直至瓊脂完全熔化，分裝試管，下面一系例步驟同配細(xì)菌培養(yǎng)基相同。 （3） 淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏一號(hào)GauseS1)，用于分離和培養(yǎng)放線菌之用，是一種合成培養(yǎng)基。 配方：可溶性淀粉 20.O克 KN03 1.0克 K2HP04 O.5克 MgS04·7H20 O.5克 NaCl O.5克 FeS04·7H20， O.01克 瓊脂 20克 自來(lái)水 1000毫升 滅菌：15磅英寸2，30分鐘。 制備方法：配制200毫升培養(yǎng)基 吸取配方液：1 KN03 20毫升

9、；l K2HP04 lO毫升；l MgSO4·7H2O lO毫升；lNaCl 10毫升；1FeSO4·7H2O O.2毫升，加水補(bǔ)足至200毫升，置電爐上加熱。用另一只搪瓷杯稱(chēng)取可溶性淀粉4克，從200毫升中取出少量加入淀粉中，用玻棒調(diào)成糊狀，待液體沸騰后，將淀粉糊洗入培養(yǎng)液中，攪勻，取下調(diào)pH至7.4，加瓊脂4克，加熱至瓊脂完全熔化為止，趁熱分裝試管，下面一系例步驟同于配制細(xì)菌培養(yǎng)基的操作方法。 （4）無(wú)菌水的制備： 無(wú)菌水，為下一次微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需用的材料。100毫升三角瓶(裝有玻璃珠)，裝自來(lái)水45毫升，試管中裝9毫升自來(lái)水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角瓶和試管

10、須預(yù)先塞好棉塞，并經(jīng)干熱滅菌。 (二)分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準(zhǔn)備 1清洗一些玻璃儀器：如三角瓶，試管，培養(yǎng)皿、吸管等。 2棉塞的制作：裝培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞。棉塞的作用為過(guò)濾空氣，使試管內(nèi)外空氣可以流通，但外界空氣中雜菌不能進(jìn)入，避免污染。試管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口約l2毫米處，用解剖針塞入少許棉花，(約11.5厘米長(zhǎng))，以防止細(xì)菌吸入口中，并避免將口中細(xì)菌吹入管內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜。吹時(shí)以能通氣但不使棉花滑下為準(zhǔn)。 教師示范做試管棉塞，同學(xué)每人做5支試管棉塞。棉塞要求不緊不松，兩頭光滑，試管棉塞的長(zhǎng)度約3厘米左右。塞入試管內(nèi)部分約占23

11、，頭部稍大約占l/3左右，見(jiàn)圖34。1 2 3 4 5 .圖3-4 棉塞的要求條件1.正確的式樣 2.管內(nèi)部太短，管外太松 3.管外太小 4.整個(gè)棉塞過(guò)松 5. 管內(nèi)部太緊，管外太松3包裝培養(yǎng)皿和吸管等。為了使培養(yǎng)皿、吸管，三角玻棒等洗凈，干熱滅菌后，不讓表面暴露，以保證無(wú)菌狀態(tài)，為此干熱滅菌前先用舊報(bào)紙包裝妥當(dāng)(見(jiàn)示范)，每組同學(xué)包培養(yǎng)皿6只(一包)。 吸管的包裝，將塞好棉花的吸管尖端，放在45厘米寬的長(zhǎng)紙條的一端，約成45º角，折疊紙條，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來(lái)。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。見(jiàn)圖35。 (三)培養(yǎng)

12、基和玻璃器材的滅菌方法 滅菌的方法，通?？梢苑譃樗拇箢?lèi)：(1)加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；(2)過(guò)濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；(4)化學(xué)藥劑滅菌和消毒。在本實(shí)驗(yàn)中，以介紹與培養(yǎng)基和玻璃器材滅菌有關(guān)的部份滅菌方法。 1干熱滅菌法(即熱空氣滅菌法)： 干熱滅菌般是利用電熱烘箱作為干熱滅菌器。前面所包裝好的玻璃器皿，如帶棉塞的三角瓶，試管、包裝好的吸管、培養(yǎng)皿等 蛋白質(zhì)含水量(%) 凝固溫度() 50 25 18 6 O 56 7480 8090 145 160一170，放入電熱烘箱中。 打開(kāi)烘箱頂部的通氣孔，接上電源加熱，使箱內(nèi)空氣的溫度達(dá)到160一1

13、70，關(guān)閉通氣孔，使箱內(nèi)的溫度保持在160左右，并維持1.52小時(shí)。時(shí)間一到，切斷電源。待溫度下降至60一70以下，方可打開(kāi)箱門(mén)取滅菌物品，否則驟冷后易使箱內(nèi)玻璃儀器破損。 2加壓蒸汽滅菌法 利用高壓滅菌器，使水的沸點(diǎn)在密閉的滅菌器內(nèi)隨壓力升高而增高(見(jiàn)表32)，來(lái)提高蒸汽的溫度和滅菌的效率。表3-2 加壓蒸汽滅菌器壓力數(shù)與蒸汽溫度間的關(guān)系壓力表所示壓力全部水蒸汽(無(wú)空氣)50空氣全部空氣 磅英寸2 公斤厘米2 5 10 15 20 O.35 0.7 1.05 1.4l 108 115 121 126 94 105 112 118 72 90 100 109 在同一溫度下，濕熱的殺菌效率比干熱

14、大，因?yàn)槲⑸锛?xì)胞蛋白質(zhì)在濕熱情況下，易于凝固，(見(jiàn)表62)。同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，當(dāng)水蒸汽與被滅菌的物品相接觸后，便放出汽化潛熱，逐步提高被滅菌物品的溫度，直至與水蒸汽的溫度相等，達(dá)到平衡為止,從而提高滅菌效率。 手提式高壓滅菌鍋滅菌的操作步驟如下： (1)在滅菌器內(nèi)加入一定量的水(有的滅菌器內(nèi)加水至止水線)。將用防水紙包扎好的滅菌物品如:培養(yǎng)基、無(wú)菌水等，放進(jìn)滅菌器內(nèi)。 (2)接通電源，進(jìn)行加熱。 (3)當(dāng)壓力到達(dá)5磅英寸2時(shí)，打開(kāi)放氣閥，使鍋內(nèi)的空氣和水蒸汽一同排出，直至壓力表的壓力恢復(fù)到零，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。 (4)當(dāng)壓力表上的壓力到達(dá)15磅英寸2(即1.05公斤平方厘米)時(shí)，此

15、時(shí)滅菌器內(nèi)的溫度達(dá)到121，維持30分鐘不變。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基滅菌時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長(zhǎng)時(shí)間。 (5)滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力下降至零時(shí)，才能打開(kāi)排氣孔，然后打開(kāi)滅菌器蓋，取出物品。 如果滅菌后的固體培養(yǎng)基要做成斜面,需趁熱放置。還需檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。 3間歇滅菌法： 常采用阿諾(Arnold)氏滅菌器和柯赫(Koch)氏滅菌器或蒸籠滅菌，常壓條件下，蒸汽溫度不超過(guò)100度。在沒(méi)有高壓滅菌器設(shè)備的情況下或不宜加壓滅菌的物品，可采用此法滅菌。 做法是：待滅菌物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮一次，每次煮沸一小時(shí)，連續(xù)三天重復(fù)進(jìn)行。在每?jī)纱握糁笾g，將物品(指培養(yǎng)基)放在37恒溫條件

16、下培養(yǎng)過(guò)夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以使下一次蒸煮時(shí)殺滅。 4過(guò)濾除菌法： 一些不能加熱滅菌的液體物質(zhì)(如維生素、血清)，可以用過(guò)濾除菌法，一般用細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行除菌。(教師示范) 細(xì)菌過(guò)濾器中的過(guò)濾板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，過(guò)濾板孔眼很小，細(xì)菌不能通去。因此，過(guò)濾后的液體就除去了細(xì)菌。在進(jìn)行過(guò)濾除菌前，整個(gè)細(xì)菌過(guò)濾器和接受液體的器皿，必須包裝妥當(dāng)進(jìn)行加壓蒸汽滅菌后方可使用。 5紫外線滅菌： 波長(zhǎng)2600一2800 A(A=110nm)之間的紫外線有很強(qiáng)的殺菌能力，一般紫外燈管能產(chǎn)生2537A的紫外光，殺死力強(qiáng)而穩(wěn)定，但穿透力弱，一般只適宜物體表面、空氣滅菌。例如

17、接種室、培養(yǎng)室、手術(shù)室、藥廠包裝室等空氣滅菌。一般30瓦燈管，9立方米空間，距地面2米，每次打開(kāi)紫外線照射半小時(shí)，就使室內(nèi)空氣滅菌。若照射紫外線時(shí)，先噴灑石碳酸等化學(xué)消毒劑，可增強(qiáng)滅菌效果。 在進(jìn)行微生物接種和分離等操作時(shí)，常須用紫外線來(lái)殺滅接種室(箱)空氣、臺(tái)面等處的微生物。(參觀示范) 紫外線雖有較強(qiáng)的殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。表34 常用化學(xué)抑茵劑和殺毒劑 類(lèi)別 代表 常用濃度 作用方式 用途及用法醇類(lèi)乙醇7075抑制細(xì)菌使蛋白質(zhì)凝固變性皮膚和器皿消毒對(duì)芽孢孢子無(wú)效醛類(lèi)甲醛37402毫升米3與蛋白質(zhì)胺基結(jié)合使其變性接中寶、

18、接中箱熏蒸，殺死空氣中微生物酚類(lèi)石炭酸來(lái)蘇兒5 25破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)變性接中室空氣及器皿消毒空氣及皮膚消毒重金屬離子 升汞 O.1 細(xì)菌細(xì)胞酶失活而中毒死亡 植物組織，如根瘤的消毒(有劇毒)氧化劑高錳酸鉀漂白粉0.131一5蛋白質(zhì)及酶氧化變性水果、皮膚、器皿消毒飲水及糞便消毒表面活性劑肥皂新潔爾滅 水稀20倍破壞細(xì)胞膜的滲透壓 皮膚、手及器血的消毒 鹵素 碘 l碘酒 蛋白質(zhì)、酶受破壞 皮膚消毒染料結(jié)晶紫24水溶液抑制細(xì)胞壁的合成作用皮膚創(chuàng)傷消毒酸類(lèi)乳酸食醋80乳酸l毫升米335毫升米3與細(xì)胞原生質(zhì)結(jié)合熏蒸消毒空氣，可預(yù)防流感病毒 堿類(lèi) 石灰水 35水溶液 破環(huán)酶的活性 地面消毒 紫外線對(duì)眼粘

19、膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，所以不能直接在紫外線燈開(kāi)啟下工作。 6化學(xué)藥劑消毒滅菌： 微生物實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑。具體見(jiàn)表64。 四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1 使用高壓蒸汽鍋時(shí)應(yīng)加充足水分，以免蒸干。鍋內(nèi)的冷空氣要排盡，否則壓力雖達(dá)要求，而溫度未達(dá)到要求，滅菌不完全。2 每次使用干熱滅菌箱時(shí)，要滅菌的玻璃器皿，必須完全干燥，以免引起玻璃的破裂。調(diào)節(jié)溫度不能高于180，否則會(huì)使棉花、紙張烤焦。滅菌后，需等溫度下降到l 60以下，才能打開(kāi)箱門(mén)，否則易使玻璃因驟冷而破裂。凡橡皮塞或橡

20、皮管不能用干熱滅菌，因高溫會(huì)使橡皮破壞。3 在使用過(guò)濾器前應(yīng)檢查過(guò)濾器有無(wú)裂隙及漏氣，濾器用后應(yīng)立即清洗。五、實(shí)驗(yàn)記錄六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 七、思考題1 配制培養(yǎng)基為什么要調(diào)節(jié)pH值？2 培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么? 配固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時(shí)要注意那些問(wèn)題?3 為什么牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基不加礦物鹽類(lèi)？4 配制培養(yǎng)基要注意哪些問(wèn)題？可否用橡皮塞、木塞來(lái)代替棉花塞？5 干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌應(yīng)用的的場(chǎng)合有何不同?6 如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?I環(huán)境中的微生物因?yàn)槲⑸锸侨庋劭床灰?jiàn)的，所以初學(xué)微生物學(xué)的學(xué)生常不知道外界環(huán)境和所有與外界接觸的身體各部位均有微生物的存在。實(shí)際上它們廣泛分布于

21、室內(nèi)外的空氣、水和土壤中，桌、椅和板凳的表面，衣服以及身體的皮膚、粘膜（例如鼻腔、口腔、喉頭等的粘膜）等處，因此，可以說(shuō)微生物是無(wú)縫不鉆，無(wú)孔不入的。在學(xué)生第一次進(jìn)入微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，建立起“微生物無(wú)所不在”這一概念是特別重要的，因?yàn)檫@樣才能體會(huì)到無(wú)菌技術(shù)和環(huán)境衛(wèi)生的必要性，才能防止外界微生物對(duì)培養(yǎng)物的污染，才能防止病原性細(xì)菌或病毒通過(guò)手或衣服進(jìn)入人體而引起傳染。從周?chē)h(huán)境和體表各部取樣生長(zhǎng)出來(lái)的微生物，雖然大多數(shù)屬正常菌群，但當(dāng)進(jìn)入破損的皮膚或傳入口內(nèi)或眼睛等處也會(huì)引起傳染，這一方面是因?yàn)橥ㄟ^(guò)培養(yǎng)，微生物的量大；另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但當(dāng)條件改變時(shí)也可能致?。ǚQ(chēng)為條件致

22、病菌），因此必須詳細(xì)閱讀操作步驟和聽(tīng)從指導(dǎo)者的說(shuō)明，特別是用過(guò)的棉簽和工作完畢后的培養(yǎng)物等均要放在指定的容器內(nèi)，接種環(huán)不僅在用前必須燒灼滅菌，而且用后也應(yīng)立即燒灼。這是整個(gè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程和今后進(jìn)行微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)均需注意的。下面的實(shí)驗(yàn)就是從實(shí)驗(yàn)室空氣、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、門(mén)的旋扭（或把手）和人的頭發(fā)、皮膚、洗手前后的手指和鼻腔粘膜等處取樣，接種于瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)12天后，觀察并比較不同來(lái)源的微生物生長(zhǎng)的數(shù)量和類(lèi)型。實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人體表面微生物的檢查一、目的要求1證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物。2比較來(lái)自不同場(chǎng)所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類(lèi)型。3體會(huì)無(wú)菌操作的重要性。二、基本原理平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長(zhǎng)

23、所需要的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來(lái)源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在37溫度下培養(yǎng)，12天內(nèi)每一菌體即能通過(guò)很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個(gè)可見(jiàn)的細(xì)胞群體的集落，稱(chēng)為菌落。每一種細(xì)菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤(rùn)、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。因此，可通過(guò)平板培養(yǎng)來(lái)檢查環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量和類(lèi)型。三、器材肉膏蛋白胨瓊脂平板，無(wú)菌水，滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈或煤氣燈，記號(hào)筆（或蠟筆），廢物缸。四、操作步驟每組在“實(shí)驗(yàn)室”和“人體”兩大部分中各選擇一個(gè)內(nèi)容做實(shí)驗(yàn)，或由教師指定分配，最后結(jié)果供全班討

24、論。1寫(xiě)標(biāo)簽任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)手操作前均需首先將器皿用記號(hào)筆做上記號(hào)，培養(yǎng)皿的記號(hào)一般寫(xiě)在皿底上。如果寫(xiě)在皿蓋上，同時(shí)觀察兩個(gè)以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開(kāi)皿蓋時(shí)，容易混淆。用記號(hào)筆寫(xiě)上班級(jí)、姓名、日期，本次實(shí)驗(yàn)還要寫(xiě)上樣品來(lái)源（如實(shí)驗(yàn)室空氣或無(wú)菌室空氣或頭發(fā)等），字盡量小些，寫(xiě)在皿底的一邊，不要寫(xiě)在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。2實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查（1）空氣 將一個(gè)肉膏蛋白胨瓊脂平板放在當(dāng)時(shí)做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無(wú)菌室或無(wú)人走動(dòng)的其他實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋。一小時(shí)后蓋上兩個(gè)皿蓋。（2）實(shí)驗(yàn)臺(tái)和門(mén)的旋鈕（a）用記號(hào)筆在皿底外面中央畫(huà)一直線，再在此線中間處畫(huà)

25、一垂直線，如圖。（b）取棉簽 左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾持棉塞（或試管帽），將其取出，將管口很快地通過(guò)煤氣燈（或酒精燈）的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出。放回棉塞（或試管帽），并將空試管放在試管架上。（c）弄濕棉簽 左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞（或試管帽）并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過(guò)多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞（或試管帽），并將滅菌水試管放在試管架上。（d）取樣 將濕棉簽在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面或門(mén)旋鈕上擦拭約2平方厘米的范圍。（e）接種 在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開(kāi)啟成

26、一縫。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動(dòng)一下），立即閉合皿蓋。將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或試管帽），燒灼管口，插入用過(guò)的棉簽，將試管放回試管架。（f）劃線 另取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來(lái)回通過(guò)火焰數(shù)次。左手拿起平板，同樣開(kāi)啟一縫，將滅過(guò)菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過(guò)瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半處。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動(dòng)的壓力不能太大，否則會(huì)刺破瓊脂。

27、閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動(dòng)至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接種環(huán)通過(guò)前面劃的線條再在瓊脂的另一半，從上向下來(lái)回劃線至12處。燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，劃最后14，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回原處。整個(gè)劃線操作均要求無(wú)菌操作，即靠近火焰，而且動(dòng)作要快。3人體細(xì)菌的檢查（1）手指（洗手前與洗手后）（a）分別在兩個(gè)瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手后（當(dāng)然，班級(jí)、姓名、日期各項(xiàng)在每次寫(xiě)標(biāo)簽時(shí)是必不可少的）。（b）移去皿蓋，將未洗過(guò)的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來(lái)回劃線，蓋上皿蓋。（c）用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來(lái)回移動(dòng)，蓋上皿蓋。（2）頭發(fā) 在揭開(kāi)皿蓋

28、的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動(dòng)數(shù)次，使細(xì)菌降落到瓊脂平板表面，然后蓋上皿蓋。（3）咳嗽 將去蓋瓊脂平板放在離口約68cm處，對(duì)著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上皿蓋。（4）鼻腔（a）按照實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（b）和（c），取出棉簽，并將其弄濕。（b）用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動(dòng)數(shù)次。（c）按實(shí)驗(yàn)臺(tái)檢查法的步驟（e）和（f），接種與劃線，然后蓋上皿蓋。4將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12天。5結(jié)果記錄方法（1）菌落計(jì)數(shù)在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。（2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不

29、同的菌落類(lèi)型。但要注意，如果細(xì)菌數(shù)量太多，會(huì)使很多菌落生長(zhǎng)在一起，或者限制了菌落生長(zhǎng)而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很開(kāi)的單個(gè)菌落。菌落特征描寫(xiě)方法如下：（a）大小 大、中、小、針尖狀?？上葘⒄麄€(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個(gè)大小范圍。（b）顏色 黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。（c）干濕情況 干燥、濕潤(rùn)、粘稠。（d）形態(tài) 圓形、不規(guī)則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。（f）透明程度 透明、半透明、不透明。（g）邊緣 整齊、不整齊。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1結(jié)果（1）將你自己的平板結(jié)果記錄于下表中。（2）與其他同學(xué)所做的結(jié)果進(jìn)行比較

30、。2思考題（1）比較各種來(lái)源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類(lèi)型最多？（2）人多的實(shí)驗(yàn)室與無(wú)菌室（或無(wú)人走動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落類(lèi)型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？（3）洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無(wú)區(qū)別？（4）通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴(kuò)散方面，你學(xué)到些什么？有什么體會(huì)？實(shí)驗(yàn)三 顯微鏡油鏡的使用和細(xì)菌形態(tài)的觀察 微生物的個(gè)體微小，肉眼難以見(jiàn)到，要研究它們，必須要用顯微鏡來(lái)觀察。因此，顯微鏡是研究微生物的重要工具。顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，使用時(shí)必須了解其基本原理和構(gòu)造，才能充分發(fā)揮其性能。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?1學(xué)習(xí)并掌握顯微鏡油鏡的使用

31、技術(shù)及維護(hù)的基本知識(shí)。 2使用油鏡觀察細(xì)菌的幾種基本形態(tài)。 3用懸滴法在高倍鏡或油鏡下觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。 二、實(shí)驗(yàn)裝置與材料：（一）光學(xué)顯徽鏡 1顯微鏡的構(gòu)造 普通光學(xué)顯微鏡可分為兩大部份：光學(xué)部分和機(jī)械部分。光學(xué)部分通常是由接目鏡、接物鏡和照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)組成的。它使檢視物放大，造成物象，是顯微鏡的重要組成部份。機(jī)械部分由鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件組成，它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。 2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 (1)顯微鏡的放大倍數(shù) 顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過(guò)物鏡第一次放大造像，再經(jīng)過(guò)目鏡在明視距離內(nèi)第二次放造像。因此，顯微

32、鏡的放大倍數(shù)等于接物鏡放大倍數(shù)和接目鏡放大倍數(shù)的乘積。即： 顯微鏡放大倍數(shù) = 接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)。 (2)顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率是表示顯微鏡辨析物體(兩端)兩點(diǎn)之間距離的能力，能夠辨析物體兩點(diǎn)問(wèn)的距離愈小，則分辨率愈高，分辨率的高低，首先取決于物鏡的鏡口率所使用光線的波長(zhǎng)，見(jiàn)圖(12) 顯微鏡的分辨率可以用以下公式表示： 式中D：為物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。 ：為可見(jiàn)光的波長(zhǎng)(平均O.55微米)。 n :為物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 :為鏡口角(即入射角)。愈大，D值愈大，分辨率愈低，n和愈大，D值愈小，分辨率愈高，因此，可以通過(guò)降低光線波長(zhǎng)，增大介質(zhì)折

33、射率和加大鏡口角(入射角)來(lái)提高分辨率。 3油鏡使用的原理： 對(duì)于個(gè)體微小，用高倍鏡仍觀察不清的微生物，則必須使用油鏡。使用時(shí)，需要在標(biāo)本和物鏡間加入一種鏡頭油。如香柏油，所以叫油浸接物鏡，簡(jiǎn)稱(chēng)油鏡。一般在鏡頭上有一黑圈或紅圈的，表示為油鏡物鏡，也有的以“OI”或”HI”字樣來(lái)表示。由于油鏡鏡面很小，使用時(shí)檢視物與鏡面又非?？拷?O.14一O.19毫米左右)，因而使進(jìn)入鏡頭的光線較少。當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭間的空氣時(shí)，由于玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣(接物鏡干燥系)，空氣折射率為l，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射現(xiàn)象，結(jié)果進(jìn)入物鏡的光線必然減少，這樣就降低了視野的照明度

34、。若載玻片與物鏡之間的介質(zhì)不是空氣，而是一層油質(zhì)，一般常用香柏油，其折射率為1.515，與玻璃的折射率(1.52)相近。光線通過(guò)載玻片后可直接通過(guò)香柏油進(jìn)入物鏡而幾乎不發(fā)生折射(接物鏡油浸系)，使視野增加照明度，這樣就能使物像更加清晰；(二)、實(shí)驗(yàn)材料 1顯微鏡，(顯微鏡燈)、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。 2細(xì)菌的染色標(biāo)本。 3培養(yǎng)1218小時(shí)的枯草桿菌(B.Subtilis) 4蓋玻片、凹玻片、接種環(huán)、酒精燈。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 (一) 顯微鏡的使用方法與步驟 1用前檢查：從顯微鏡箱中取出顯微鏡時(shí)，用右手拿鏡臂，左手托鏡座，直立移動(dòng)，輕放在平穩(wěn)的桌面上，檢查各部零件是否齊全，鏡頭是否清

35、潔，否則報(bào)告老師。 2調(diào)節(jié)光照：正確的照明是獲得良好檢查效果的前提。用粗調(diào)節(jié)器提升鏡筒，將低倍物鏡旋到鏡筒下方，使鏡頭和載物臺(tái)距離約為5毫米左右，左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度(在天然的光線下觀察，一般用平面反光鏡；若以燈光為光源，則一般多用凹面反光鏡)。調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱，然后調(diào)節(jié)聚光鏡的位置(酌予升降)，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的光亮為止。 3低倍鏡觀察：低倍物鏡視野面廣，焦點(diǎn)深度較深，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)確定觀察位置，故應(yīng)先用低倍鏡觀察為宜。 將載片標(biāo)本(涂面朝上)置于載物臺(tái)的標(biāo)本夾上，并將標(biāo)本部位處于物鏡的正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭下降至鏡面距離檢視物大約10毫米處。然后以左眼看目鏡，另一眼睜開(kāi)，

36、一邊觀察視野，一邊扭動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使鏡頭緩慢地升高，至視野內(nèi)出現(xiàn)物像后，改用細(xì)調(diào)節(jié)器，上下微微轉(zhuǎn)動(dòng)，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物像，選擇適宜部位，移到視野中心，待換中、高倍鏡觀察。 4依次再進(jìn)行中倍、高倍觀察。在物鏡依次由低倍至中倍、高倍的觀察過(guò)程中，應(yīng)逐次上升聚光鏡以調(diào)節(jié)光線亮度，同樣選擇適宜的部位移至視野中央。 5油鏡觀察：將聚光鏡提升至最高點(diǎn)，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，移開(kāi)高倍鏡，使高倍鏡和油鏡成“八”字形，在標(biāo)本中央滴一小滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，微微轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，可見(jiàn)清晰物像，如果油鏡上升已離開(kāi)由面還未看清物像的話，需重新調(diào)節(jié)。此時(shí)可從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡

37、浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接。應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不能用力過(guò)猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì)損壞鏡頭。用右手向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，當(dāng)視野中有模糊的標(biāo)本物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器，直到看清物象為止。 6換片：另?yè)Q新的標(biāo)本片，必須從第三條開(kāi)始操作。7用后復(fù)原：觀察完畢，上旋鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去鏡頭上的殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。機(jī)械部件用細(xì)軟布擦去灰塵和冷凝水，下降鏡筒，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形置于載物臺(tái)上。下降聚光鏡，(切勿使接物鏡與聚光鏡相碰受損)，反光鏡垂直于鏡座。放進(jìn)顯微鏡箱中鎖好，并放入指定的顯微鏡柜中。四、實(shí)驗(yàn)注意事

38、項(xiàng)顯微鏡顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)： (1)不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件，以免損壞。 (2)鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布擦，以保證鏡面的光潔度。 (3)觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低倍鏡、中倍鏡、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可用粗調(diào)節(jié)器向下旋，以免物鏡碰到玻片損傷鏡面或壓碎玻片。 (4)觀察時(shí)，兩眼睜開(kāi)，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，。以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。 (5)拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿動(dòng)。(6)顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片生霉菌而腐蝕鏡片。(7)在轉(zhuǎn)動(dòng)粗細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)焦距時(shí)，要從側(cè)面觀察，切勿使物鏡鏡頭與玻片相碰，以免損壞鏡頭。(8)在觀察細(xì)菌、放線菌的形態(tài)時(shí)，由于采用油鏡頭透鏡口徑較小，所以光線要調(diào)到最強(qiáng)，便于觀察。 五、實(shí)驗(yàn)記錄六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理七、思考題1. 如何區(qū)別顯微鏡的低倍鏡、高倍鏡和油鏡？2. 使用油鏡時(shí)，為何必須鏡頭油？3. 鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？實(shí)驗(yàn)四 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一、目的要求1明確顯微鏡計(jì)數(shù)的原理。2學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。二、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種