實(shí)驗(yàn)二動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的配制與滅菌1

1、細(xì)胞生物學(xué)與細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)的總體安排細(xì)胞生物學(xué)與細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)的總體安排（10-18周）周） 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的技術(shù)參數(shù)及特殊光鏡的演示實(shí)驗(yàn)顯微鏡的技術(shù)參數(shù)及特殊光鏡的演示實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的配制與滅菌動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的配制與滅菌 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 動(dòng)物細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)法動(dòng)物細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)法 實(shí)驗(yàn)四 動(dòng)物組織的消化及細(xì)胞凍存動(dòng)物組織的消化及細(xì)胞凍存 實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞復(fù)蘇及活力測(cè)定細(xì)胞復(fù)蘇及活力測(cè)定 實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞骨架的光鏡觀察細(xì)胞骨架的光鏡觀察 實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 小鼠骨髓細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本的制作小鼠骨髓細(xì)胞染色體玻片標(biāo)本的制作 實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 細(xì)胞融合細(xì)胞融合 實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九 血涂片的制備及細(xì)胞

2、大小的測(cè)量血涂片的制備及細(xì)胞大小的測(cè)量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 了解動(dòng)物了解動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)條件設(shè)施的要求；培養(yǎng)對(duì)條件設(shè)施的要求； 掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的種類(lèi)及作用；掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的種類(lèi)及作用； 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)各種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制方法及各種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制方法及滅菌方法。滅菌方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 無(wú)污染環(huán)境（無(wú)毒、無(wú)菌）：無(wú)菌培養(yǎng)室（更衣間、緩沖無(wú)污染環(huán)境（無(wú)毒、無(wú)菌）：無(wú)菌培養(yǎng)室（更衣間、緩沖間、操作間）、新潔爾滅擦拭地面、超凈工作臺(tái)間、操作間）、新潔爾滅擦拭地面、超凈工作臺(tái) 溫度適宜；溶解氧、溫度適宜；溶解氧、pH和氣體環(huán)境和氣體環(huán)境 各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分：糖（

3、能量）、氨基酸（合成蛋白質(zhì)的原料各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分：糖（能量）、氨基酸（合成蛋白質(zhì)的原料）、維生素（細(xì)胞內(nèi)酶的輔酶或輔基）、生長(zhǎng)因子（激素）、維生素（細(xì)胞內(nèi)酶的輔酶或輔基）、生長(zhǎng)因子（激素類(lèi)等促進(jìn)細(xì)胞增殖）類(lèi)等促進(jìn)細(xì)胞增殖） 滲透壓滲透壓 附著物（貼壁生長(zhǎng)）等附著物（貼壁生長(zhǎng)）等1、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件：無(wú)機(jī)鹽、微量元無(wú)機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、氨素、葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因基酸、促生長(zhǎng)因子等子等 溫度：溫度：36363737 pH : 7.27.4 95%95%空氣和空氣和5%CO5%CO2 2 (維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)液pH) 培養(yǎng)基中加入抗培養(yǎng)基中加入抗生素生素 超凈臺(tái)超凈臺(tái)2、

4、常用細(xì)胞培養(yǎng)用液：、常用細(xì)胞培養(yǎng)用液： 水水 培養(yǎng)基培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基 生理鹽生理鹽液液：PBS 消化用液消化用液：胰蛋白酶胰蛋白酶 抗生素液抗生素液：青鏈霉素青鏈霉素3、常用的滅菌方式：、常用的滅菌方式： 紫外線消毒紫外線消毒: 紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。紫外線的直接作用是通過(guò)破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過(guò)紫外線照射分解空氣中的氧氣形成臭氧殺死微生物。 蒸汽濕熱滅菌法：蒸汽濕熱滅菌法： 是目前最常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝

5、固變性而使微生物死亡。 濕熱滅菌法一般采用121，滅菌20-30min。 高溫干熱滅菌法：高溫干熱滅菌法：恒溫干燥箱，恒溫干燥箱， 120C150C的高熱。的高熱。果蠅培養(yǎng)瓶、玻璃試劑瓶等。果蠅培養(yǎng)瓶、玻璃試劑瓶等。 過(guò)濾除菌：過(guò)濾除菌：是將液體或氣體通過(guò)有微孔的濾膜是將液體或氣體通過(guò)有微孔的濾膜過(guò)濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留過(guò)濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。培養(yǎng)基等的滅菌。，從而達(dá)到除菌的方法。培養(yǎng)基等的滅菌。 化學(xué)消毒法：化學(xué)消毒法：僅限于表面的消毒。用于不能用物理方僅限于表面的消毒。用于不能用物理方法進(jìn)行消毒的物品、空氣、工作面、操作者皮膚以及某

6、些法進(jìn)行消毒的物品、空氣、工作面、操作者皮膚以及某些實(shí)驗(yàn)器皿等。實(shí)驗(yàn)器皿等。 酒精酒精 甲醛甲醛 高錳酸鉀高錳酸鉀 抗生素：抗生素：用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救急救”措施措施三、實(shí)驗(yàn)儀器與材料三、實(shí)驗(yàn)儀器與材料 儀器儀器：玻璃杯，玻璃棒，電子天平，量筒， PH試紙，試劑瓶等 試劑試劑：NaCl, KCl, Na2HPO412H2O，KH2PO4，HCl, NaOH，NaHCO3，DMEM， 蒸餾水，雙蒸水四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 1、配制、配制PBSPBS（1 1

7、）燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水）燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水; ;（2 2）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品，依次放入燒杯）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品，依次放入燒杯; ;（3 3）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解; ;（4 4）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)PHPH值使之約為值使之約為7.2;7.2;（5 5）定容；（）定容；（6 6）高壓滅菌）高壓滅菌,120,120 1515分鐘；（分鐘；（7 7） 分裝保存分裝保存。2 2、 配制配制100ml DMEM100ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基（1 1） 燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水; ;（2 2）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品）準(zhǔn)確稱(chēng)

8、量藥品DMEM 1.17gDMEM 1.17g，（3 3）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品NaHCONaHCO3 3 0.37g; 0.37g;（4 4）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品谷胺酰胺）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品谷胺酰胺0.003g0.003g；（5 5）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品）準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品HEPESHEPES（乙基哌嗪乙硫磺酸）（乙基哌嗪乙硫磺酸） 0.5958g, 0.5958g, 依次放入燒杯依次放入燒杯; ;加入青霉素加入青霉素100IU/ml100IU/ml、鏈霉素、鏈霉素100ug/ml.100ug/ml.（6 6）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解; ;（7 7）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)P

9、HPH值使之約為值使之約為7.2;7.2;（8 8） 定容；（定容；（9 9） 過(guò)濾滅菌；（過(guò)濾滅菌；（1010）分裝保存。）分裝保存。3、PBS的高壓滅菌的高壓滅菌高壓滅菌高壓滅菌鍋，鍋，120，15分鐘分鐘2013-2014-1遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)14、DMEM培養(yǎng)基濾器滅菌培養(yǎng)基濾器滅菌（1）將塑料環(huán)放在上蓋與下底之間，鎖緊。用雙層牛皮紙包好高壓蒸汽滅菌。 （2）選一個(gè)適當(dāng)?shù)娜萜?，如錐形瓶試管窄口瓶等亦高壓蒸汽滅菌。 （3）將微孔濾膜用平頭鑷子夾住，放在微孔濾膜裝置中一起高壓蒸汽滅菌。 （4）將需要滅菌的實(shí)驗(yàn)器材溶液配置好。 （5）將無(wú)菌的微孔濾膜裝置由下底口套在無(wú)菌的容器上。用塑料注射筒吸取要滅菌的溶液。 （6）注射筒口插入微孔濾膜過(guò)濾裝置之上蓋口。 擠壓注射筒的推管，使溶液流經(jīng)微孔濾膜流入無(wú)菌容器中。（7）移去微孔濾膜，將容器口通過(guò)酒精燈火焰，蓋上蓋子標(biāo)上溶液名稱(chēng)及日期。 （8）拆開(kāi)微孔濾膜裝置，將微孔濾膜丟掉（或滅菌后丟棄），其它裝置清洗干凈。 本次實(shí)驗(yàn)的任務(wù)本次實(shí)驗(yàn)的任務(wù) 每組配制每組配制1LPBS 生理鹽液，并包好瓶口；生理鹽液，并包好瓶口； 每組仔細(xì)清洗每組仔細(xì)清洗5-6個(gè)培養(yǎng)皿和細(xì)胞培養(yǎng)瓶（個(gè)培養(yǎng)皿和細(xì)胞培養(yǎng)瓶（保證每人一個(gè)），分別一