實驗二動物細胞培養(yǎng)液的配制與滅菌1

1、細胞生物學(xué)與細胞工程實驗的總體安排細胞生物學(xué)與細胞工程實驗的總體安排（10-18周）周） 實驗一 顯微鏡的技術(shù)參數(shù)及特殊光鏡的演示實驗顯微鏡的技術(shù)參數(shù)及特殊光鏡的演示實驗 實驗二實驗二 動物細胞培養(yǎng)液的配制與滅菌動物細胞培養(yǎng)液的配制與滅菌 實驗三實驗三 動物細胞的組織塊培養(yǎng)法動物細胞的組織塊培養(yǎng)法 實驗四 動物組織的消化及細胞凍存動物組織的消化及細胞凍存 實驗五 細胞復(fù)蘇及活力測定細胞復(fù)蘇及活力測定 實驗六實驗六 細胞骨架的光鏡觀察細胞骨架的光鏡觀察 實驗七實驗七 小鼠骨髓細胞染色體玻片標本的制作小鼠骨髓細胞染色體玻片標本的制作 實驗八實驗八 細胞融合細胞融合 實驗九實驗九 血涂片的制備及細胞

2、大小的測量血涂片的制備及細胞大小的測量一、實驗?zāi)康呐c要求一、實驗?zāi)康呐c要求 了解動物了解動物細胞細胞培養(yǎng)對條件設(shè)施的要求；培養(yǎng)對條件設(shè)施的要求； 掌握動物細胞培養(yǎng)用液的種類及作用；掌握動物細胞培養(yǎng)用液的種類及作用； 學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)各種動物細胞培養(yǎng)用液的配制方法及各種動物細胞培養(yǎng)用液的配制方法及滅菌方法。滅菌方法。二、實驗原理二、實驗原理 無污染環(huán)境（無毒、無菌）：無菌培養(yǎng)室（更衣間、緩沖無污染環(huán)境（無毒、無菌）：無菌培養(yǎng)室（更衣間、緩沖間、操作間）、新潔爾滅擦拭地面、超凈工作臺間、操作間）、新潔爾滅擦拭地面、超凈工作臺 溫度適宜；溶解氧、溫度適宜；溶解氧、pH和氣體環(huán)境和氣體環(huán)境 各類營養(yǎng)成分：糖（

3、能量）、氨基酸（合成蛋白質(zhì)的原料各類營養(yǎng)成分：糖（能量）、氨基酸（合成蛋白質(zhì)的原料）、維生素（細胞內(nèi)酶的輔酶或輔基）、生長因子（激素）、維生素（細胞內(nèi)酶的輔酶或輔基）、生長因子（激素類等促進細胞增殖）類等促進細胞增殖） 滲透壓滲透壓 附著物（貼壁生長）等附著物（貼壁生長）等1、細胞培養(yǎng)的基本條件：、細胞培養(yǎng)的基本條件：無機鹽、微量元無機鹽、微量元素、葡萄糖、氨素、葡萄糖、氨基酸、促生長因基酸、促生長因子等子等 溫度：溫度：36363737 pH : 7.27.4 95%95%空氣和空氣和5%CO5%CO2 2 (維持培養(yǎng)液維持培養(yǎng)液pH) 培養(yǎng)基中加入抗培養(yǎng)基中加入抗生素生素 超凈臺超凈臺2、

4、常用細胞培養(yǎng)用液：、常用細胞培養(yǎng)用液： 水水 培養(yǎng)基培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基 生理鹽生理鹽液液：PBS 消化用液消化用液：胰蛋白酶胰蛋白酶 抗生素液抗生素液：青鏈霉素青鏈霉素3、常用的滅菌方式：、常用的滅菌方式： 紫外線消毒紫外線消毒: 紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射分解空氣中的氧氣形成臭氧殺死微生物。 蒸汽濕熱滅菌法：蒸汽濕熱滅菌法： 是目前最常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝

5、固變性而使微生物死亡。 濕熱滅菌法一般采用121，滅菌20-30min。 高溫干熱滅菌法：高溫干熱滅菌法：恒溫干燥箱，恒溫干燥箱， 120C150C的高熱。的高熱。果蠅培養(yǎng)瓶、玻璃試劑瓶等。果蠅培養(yǎng)瓶、玻璃試劑瓶等。 過濾除菌：過濾除菌：是將液體或氣體通過有微孔的濾膜是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留過濾，使大于濾膜孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌的方法。培養(yǎng)基等的滅菌。，從而達到除菌的方法。培養(yǎng)基等的滅菌。 化學(xué)消毒法：化學(xué)消毒法：僅限于表面的消毒。用于不能用物理方僅限于表面的消毒。用于不能用物理方法進行消毒的物品、空氣、工作面、操作者皮膚以及某

6、些法進行消毒的物品、空氣、工作面、操作者皮膚以及某些實驗器皿等。實驗器皿等。 酒精酒精 甲醛甲醛 高錳酸鉀高錳酸鉀 抗生素：抗生素：用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴重時的的重要手段以及作為微生物污染不嚴重時的“急救急救”措施措施三、實驗儀器與材料三、實驗儀器與材料 儀器儀器：玻璃杯，玻璃棒，電子天平，量筒， PH試紙，試劑瓶等 試劑試劑：NaCl, KCl, Na2HPO412H2O，KH2PO4，HCl, NaOH，NaHCO3，DMEM， 蒸餾水，雙蒸水四、實驗內(nèi)容四、實驗內(nèi)容1 1、配制、配制PBSPBS（1 1

7、）燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水）燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水; ;（2 2）準確稱量藥品，依次放入燒杯）準確稱量藥品，依次放入燒杯; ;（3 3）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解; ;（4 4）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)PHPH值使之約為值使之約為7.2;7.2;（5 5）定容；（）定容；（6 6）高壓滅菌）高壓滅菌,120,120 1515分鐘；（分鐘；（7 7） 分裝保存分裝保存。2 2、 配制配制100ml DMEM100ml DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基（1 1） 燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水燒杯中加適量的蒸餾水或去離子水; ;（2 2）準確稱量藥品）準確稱

8、量藥品DMEM 1.17gDMEM 1.17g，（3 3）準確稱量藥品）準確稱量藥品NaHCONaHCO3 3 0.37g; 0.37g;（4 4）準確稱量藥品谷胺酰胺）準確稱量藥品谷胺酰胺0.003g0.003g；（5 5）準確稱量藥品）準確稱量藥品HEPESHEPES（乙基哌嗪乙硫磺酸）（乙基哌嗪乙硫磺酸） 0.5958g, 0.5958g, 依次放入燒杯依次放入燒杯; ;加入青霉素加入青霉素100IU/ml100IU/ml、鏈霉素、鏈霉素100ug/ml.100ug/ml.（6 6）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解）人工攪拌或磁力攪拌器攪拌使藥品充分溶解; ;（7 7）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)P

9、HPH值使之約為值使之約為7.2;7.2;（8 8） 定容；（定容；（9 9） 過濾滅菌；（過濾滅菌；（1010）分裝保存。）分裝保存。3、PBS的高壓滅菌的高壓滅菌高壓滅菌高壓滅菌鍋，鍋，120，15分鐘分鐘2013-2014-1遺傳學(xué)實驗14、DMEM培養(yǎng)基濾器滅菌培養(yǎng)基濾器滅菌（1）將塑料環(huán)放在上蓋與下底之間，鎖緊。用雙層牛皮紙包好高壓蒸汽滅菌。 （2）選一個適當?shù)娜萜?，如錐形瓶試管窄口瓶等亦高壓蒸汽滅菌。 （3）將微孔濾膜用平頭鑷子夾住，放在微孔濾膜裝置中一起高壓蒸汽滅菌。 （4）將需要滅菌的實驗器材溶液配置好。 （5）將無菌的微孔濾膜裝置由下底口套在無菌的容器上。用塑料注射筒吸取要滅菌的溶液。 （6）注射筒口插入微孔濾膜過濾裝置之上蓋口。 擠壓注射筒的推管，使溶液流經(jīng)微孔濾膜流入無菌容器中。（7）移去微孔濾膜，將容器口通過酒精燈火焰，蓋上蓋子標上溶液名稱及日期。 （8）拆開微孔濾膜裝置，將微孔濾膜丟掉（或滅菌后丟棄），其它裝置清洗干凈。 本次實驗的任務(wù)本次實驗的任務(wù) 每組配制每組配制1LPBS 生理鹽液，并包好瓶口；生理鹽液，并包好瓶口； 每組仔細清洗每組仔細清洗5-6個培養(yǎng)皿和細胞培養(yǎng)瓶（個培養(yǎng)皿和細胞培養(yǎng)瓶（保證每人一個），分別一