植物組織內(nèi)丙二醛(MDA)含量的測定實驗設(shè)計

1、 實驗設(shè)計（一）題目：植物組織內(nèi)丙二醛（MDA）含量的測定比色法組數(shù)：第七組組長：楊曼學(xué)校：南通大學(xué)年級：13級專業(yè)：生物工程131實驗?zāi)康?1，根據(jù)待測植物的抗逆生理，掌握對待測植物做逆境處理的方法 2，比較同種脅迫逆境處理對待測植物不同部位生長的影響 3，比較不同脅迫逆境處理對待測植物生長的影響 4，了解植物組織內(nèi)MDA積累水平對植物生理狀態(tài)的影響 5，掌握比色法測定植物組織內(nèi)MDA含量的方法和步驟實驗原理 1，植物抗逆是植物對抗不良環(huán)境，比如抗旱、抗鹽堿、抗?jié)?、抗風(fēng)、抗凍、抗病蟲害等的能力. 在自然界條件下，由于不同的地理位置和氣候條件以及人類活動等多方面原因，造成了各種不良環(huán)境，超出了

2、植物正常生長、發(fā)育所能忍受的范圍，致使植物受到傷害甚至死亡。這些對植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境稱為逆境（stress）或脅迫。而植物對不良環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗力為抗逆性（stress resistance）或抗性. 逆境的種類多種多樣，包括物理的、化學(xué)的、生物因素等，可分為生物逆境和非生物逆境兩大類。對植物產(chǎn)生重要影響的非生物逆境主要有水分（干旱和淹澇）、溫度（高、低溫）、鹽堿、環(huán)境污染等理化逆境，生物逆境主要包括病害、蟲害、雜草等。理化逆境之間通常是相互聯(lián)系的；例如水分虧缺通常伴隨著鹽堿和高溫逆境，水分脅迫、低溫脅迫、病蟲害和大氣污染等都可引起活性氧傷害。 2，文獻(xiàn)研究結(jié)果表明,隨著鹽度增加,米草株高呈

3、下降趨勢,在高鹽度(50%)下,米草葉面積、葉長等指標(biāo)與對照組相比明顯下降,鮮重與低鹽度組比較顯著下降。【1】 提摩西草喜冷涼濕潤氣候。越冬性好。春季氣溫高于5時開始返青，秋季氣溫低于5停止生長。較耐淹浸，不耐干旱。在35以上的持續(xù)高溫干燥條件下，不能安渡夏季。要求中性及弱酸性土壤。耐堿性較弱，在石灰質(zhì)含量多的土壤上生長不良。 因此，根據(jù)待測植物護花米草和提摩西草的抗逆能力并且考慮可行性，對提摩西草分別做堿逆境處理和高溫逆境處理，然后再測量其體內(nèi)丙二醛含量的變化。 3，植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，導(dǎo)致自由基(·O2，·OH等)積累，誘導(dǎo)細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作

4、用，即膜脂過氧化反應(yīng)。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征；使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。MDA的積累可能對膜和細(xì)胞造成一定的傷害。 4，丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，所以其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。在酸性和高溫度條件下，它可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其最大吸收波長在532nm，最小吸收波長在600nm。 5，但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm，532n

5、m處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加（植物在遭受低溫、干旱、鹽堿等逆境時，機體會響應(yīng)這樣的環(huán)境變化，而后調(diào)節(jié)有些酶的合成、活性等，結(jié)果是提高可溶性糖和氨基酸的濃度，提高細(xì)胞內(nèi)滲透壓，進而提高細(xì)胞的滲透吸水能力，適應(yīng)逆境），因此測定植物組織MDATBA反應(yīng)物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g/g DW，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5mol/L。測量方法：雙組分分

6、光光度計法 據(jù)朗伯-比爾定律：DkCL，當(dāng)液層厚度為1cm時，k=D/C，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時，某一波長下的消光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的消光度之和。  已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40，7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0，532nm波長下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式：C1(mmol/L)=11.71A450               &#

7、160;                     C2(mol/L)=6.45(A532A600)0.56A450         式中：C1為可溶性糖的濃度； C2為MDA的濃度； A450、A532、A600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。實驗器材實驗材料： 足量的提摩西草實驗試劑： 碳酸鈉，碳酸氫鈉，植物營養(yǎng)液，10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸（TBA）（先加少量的氫氧化鈉（1mol/L）溶解，再用10的三氯

8、乙酸定容）;石英砂。實驗設(shè)備： 光照培養(yǎng)箱，燒杯（500mL)，紫外可見分光光度計1臺；離心機1臺；電子天平1臺；10ml離心管3支；研缽三套；試管15支；pH試紙；量筒；刻度吸管：10ml 1支，2ml 1支；剪刀1把。樣品采集 1，堿脅迫 將兩種堿性鹽碳酸鈉和碳酸氫鈉按摩爾比1:1混合，作為堿脅迫處理試劑。設(shè)30,60,90，120和150mmol/L5個濃度梯度（pH 9.7010.11).選取長勢均勻的提摩西14棵，隨機分成7組，每組2棵，即為2次重復(fù)。其中1組為對照，1組用于測定脅迫處理起始時的生物量，其余5組為脅迫處理組。所有待測植物除澆灌液不同外，其他生長條件均相同，且生長環(huán)境溫

9、度為610。以含有相應(yīng)混合鹽的營養(yǎng)液為處理液，每棵用200mL分三次透灌，對照用200mL營養(yǎng)液透灌。連續(xù)處理12小時，在最后一次處理后的次日上午取樣。小心取出每棵中的葉片和根部，并根據(jù)組號對取出的葉片做相應(yīng)的標(biāo)記。取出的葉片用蒸餾水洗凈，并用吸水紙吸去附著的水分?！?】 2，高溫脅迫 選取長勢均勻的提摩西草9棵，隨機分成3組，每組3棵。其中1組為對照，1組用于測定脅迫處理起始時的生物量，其余1組為脅迫處理組。將處理組置于37，光周期8h/16h(暗/光），光照強度4000lx的光照培養(yǎng)箱中，以進行高溫脅迫處理.處理時間分別為3h,6h,9h,12h,15h。每個時間點分別設(shè)置對照。對照組在普

10、通適宜環(huán)境下生長。每處理時間點取處理組一部分葉片和對照組一部分葉片分別進行丙二醛含量的測定。【3】待測植物脅迫處理的數(shù)據(jù)記錄表格如圖所示一，堿脅迫 處理 堿度（mmol/L）植物葉片中MDA含量（mol/g）植物根部MDA含量（mol/g）堿脅迫處理起始 0 處理組 （1） 30 處理組 （2） 60 處理 組 （3） 90處理組 （4） 120 處理組 （5） 150對照組 0二，高溫脅迫處理光照時間(h)植物葉片中MDA含量（mol/g）對照組植物葉片中MDA含量（mol/g）高溫脅迫處理起始 0 處理組 3 6 9 處理組 12 15實驗步驟 1，實驗材料  受堿或低溫逆境脅迫

11、的提摩西草葉片或根部  2. MDA的提取  稱取剪碎的試材1g，加入2ml 10TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml TCA進一步研磨，勻漿離心（4000×g）10min，上清液為樣品提取液。  3. 顯色反應(yīng)和測定  吸取離心的上清液2ml，加入2ml 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。 4. 計算含量計算植物樣品提取液中MDA的濃度：C(mol/L)=6.45(A532A600)0.56A450     計算測定樣品

12、中MDA的含量：  MDA（mol/g FW） (MDA濃度(umol/L)*提取液體積 (ml) / 植物組織鮮重(g)實驗預(yù)期結(jié)果1. 堿脅迫下，隨著堿濃度的增加，植物體內(nèi)MDA的含量也在不斷增加，且根部MDA的含量稍大于葉片中MDA的含量。2，高溫脅迫下，隨著光照時間的延長，植物體內(nèi)MDA的含量不斷增加。3，將堿脅迫與高溫脅迫得到的數(shù)據(jù)相比較，發(fā)現(xiàn)堿脅迫對提摩西草生長的影響較大注意事項1. 0.1-0.5%的三氯乙酸對MDATBA反應(yīng)較合適,若高于此濃度,其反應(yīng)液的非專一性吸收偏高;  2. MDA-TBA顯色反應(yīng)的加熱時間,最好控制沸水浴10-15min之間.時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降;   3. 如待測液渾濁,可適當(dāng)增加離心力及時間,最好使用低溫離心機離心.   實驗項目預(yù)期分配 姓名 任務(wù) *曼實驗設(shè)計；定時透灌堿處理組營養(yǎng)液及對照組營養(yǎng)液；稱取并剪碎試材，制得樣品提取液；數(shù)據(jù)記錄 *芳待測植物選取，分組，貼標(biāo)簽；MDA顯色反應(yīng)和測定，MDA含量的計算 *晨配制堿脅迫試劑；取脅迫完成后的處理組和對