Westernblot賊拉

1、Western-Blot操作流程1. 試劑配制1.1母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g蒸餾水 200ml溶解后，用濃鹽酸調pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl7.4 約17ml7.5 約16m7.6 約15ml8.0 約10ml1.1.2 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g異丙醇 100ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，-20保存。1.1.3 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸餾水至 500m

2、l溶解后，高壓滅菌，室溫保存。1.1.4 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO ·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸餾水至 1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。1.1.5 10SDS SDS 10g蒸餾水至 100ml50水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。1.1.6 10過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g超純水 1.0ml溶解后，4保存，保存時間為1周。（可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中，一次性多裝幾管，使用時加入超純水即可）1.1.7 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW12

3、1.14) 45.43g超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。1.1.8 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。1.1.9 40Acr/Bic（37.5:1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g超純水至 100ml溶解后4保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。1.1.10 30Acr/Bic（29:1） 丙稀酰胺（Acr） 29g甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g超純水

4、至 100ml溶解后4保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。1.1.11 20Tween20 Tween20 20ml蒸餾水至 100ml混勻后4保存。1.2 使用液配制 單去污劑裂解液（PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438g TritonX-100 0.5ml蒸餾水至 50ml混勻后4保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。一般實際用的比較多的其實是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：50 mM Tris-HCl pH

5、 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS。l 裂解得到的蛋白樣品，由于含有較高的蛋白去垢劑干擾，不能用Brandford法測定蛋白濃度,要用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。l RIPA裂解液的配方有很多種，根據(jù)其裂解液的強度大致可以分為強、中、弱三類。對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強、中或弱)。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強或中)。如果

6、發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強度過強，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 對于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強、中)或SDS裂解液。 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸餾水至 2000ml1.2.3 G250考馬斯亮藍溶液（蛋白定量專用） 考馬斯亮藍G250 100mg95乙醇 50ml磷酸 100m

7、l蒸餾水至 1000ml配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。1.2.4 0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g蒸餾水至 100 ml高溫滅菌后，室溫保存。 100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA） BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后-20保存。制作蛋白標準曲線時，用0.15 mol/L NaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，-20保存。 還原型5 X SDS上樣緩沖液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39gS

8、DS 0.5g溴酚藍 0.025甘油 2.5ml混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4保存。1.2.7 電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用35次。（電泳液可以回收重復利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鮮的電泳緩沖液）1.2.8 轉移緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8gSDS 0.37g甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用35次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5

9、次左右，不然影響轉移效率）。（先用蒸餾水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后補足液體。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比較困難）1.2.9 10X麗春紅染液 麗春紅S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g蒸餾水至 100ml使用時將其稀釋10倍。 TBS緩沖液 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸餾水至 1000ml（可以配制成10×TBS緩沖液進行保存，稀釋10倍使用）1.2.10 TBST緩沖液 20Tween20 1.65mlTBS 700ml混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。1.2.11 封閉液 (最

10、好現(xiàn)配現(xiàn)用)脫脂奶粉（國產(chǎn)，光明牌） 5gTBST 100ml 洗脫抗體緩沖液（可用可不用）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巰基乙醇) 700 l（通風廚里加）SDS 2g0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml超純水至 100ml配制時，在通風廚內進行。4保存。可重復使用1次。1.2.12 顯色液PCA22l-Lum50l-1M Tris-Hcl(pH8.5)500l500lH2O2-5lH2O4.428 ml4.5 ml4顯影液（5X） 自來水（加熱至50） 375ml （以下藥品加到溫水中）米吐爾 1.55g亞硫酸鈉（無水）

11、22.5g碳酸鈉（無水） 33.75g溴化鉀 20.95g補水至 500ml配制時，上述藥品應逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4保存。使用時用自來水稀釋至1倍。（不需要自己配制，有錢的直接買柯達的顯影液，上千；沒錢的到專業(yè)的照相器材市場購買即可，很便宜，一包5毛錢左右）5 定影液 自來水（5060） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸鈉 240g亞硫酸鈉（無水） 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g鉀明礬 15g（水溫冷至30以下時再加入）加水定容至 1000ml，室溫保存。6 抗體 用TBST稀釋至一定濃度使用，建議使用雜交袋（小商品市場購買，很便

12、宜，可以多買一點，但是務必注意質量，千萬不能漏，不然抗體就浪費了，在使用之前先檢查一下雜交袋的完整性）。7 化學發(fā)光試劑 分A和B兩種試劑，有錢可以購買Amersham、Pierce或者Santa Cruz的，沒錢的話碧云天的ECL也能湊合。8 40%聚丙烯酰胺的濃縮膠和分離膠配制組 分 10分離膠（兩塊膠，10ml） 4濃縮膠（兩塊膠，5ml）超純水 4.85ml 3.16ml40Acr/Bic（37.5:1） 2.5ml 0.5ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 1.26ml10SDS

13、100 l 50 l10%AP 50 l 25lTEMED 5 l 5 l*加TEMED后，立即混勻即可灌膠。（為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍，根據(jù)實驗當時的溫度適當調整）組 分 15分離膠（兩塊膠，10ml） 7.8濃縮膠（兩塊膠，5ml）超純水 2.34ml 2.065ml40Acr/Bic（37.5:1） 3.75ml 0.975ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 3.75ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 1.875ml10SDS 100 l 50 l10%AP 50 l 25lTEM

14、ED 10l 5 l9 30%聚丙烯酰胺的濃縮膠和分離膠配制l SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍*丙烯酰胺濃度（%） 線性分離范圍（kD）15 124310 16687.5 36945.0 57212*雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為 1：29。l 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液溶液成分總體積 5ml總體積 10ml總體積 15ml總體積 20ml總體積 25ml總體積 30ml6% 水2.6ml5.3ml7.9ml10.6ml13.2ml15.9ml30%丙烯酰胺1.0ml2.0ml3.0ml4.0ml5.0ml6.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3

15、ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%過硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED4l8l12l16l20l24l8%水2.3ml4.6ml6.9ml9.3ml11.5ml13.9ml30%丙烯酰胺1.3ml2.7ml4.0ml5.3ml6.7ml8.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%過硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED3l6l9l12

16、l15l18l10%水1.9ml4.0ml5.9ml7.9ml9.9ml11.9ml30%丙烯酰胺1.7ml3.3ml5.0ml6.7ml8.3ml10.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%過硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED2l4l6l8l10l12l12%水1.6ml3.3ml4.9ml6.6ml8.2ml9.9ml30%丙烯酰胺2.0ml4.0ml6.0ml8.0ml10.0ml12.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3m

17、l2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%過硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED2l4l6l8l10l12l15%水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS50l100l150l200l250l300l10%過硫酸胺50l100l150l200l250l300lTEMED2l4l6l8l1

18、0l12l配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5% 濃縮膠溶液溶液成分總體積3ml總體積4ml總體積5ml總體積6ml總體積8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1M Tris(pH 6.8)0.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10% SDS30l40l50l60l80l10%過硫酸胺30l40l50l60l80lTEMED3l4l5l6l8l操作步驟一、蛋白樣品制備（一） 單層貼壁細胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或將瓶直立放置一會兒使

19、殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、每瓶細胞加3ml 4預冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10l PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）4、每瓶細胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）6、于4下1

20、2000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）7、將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于-20保存。（個人感覺上述方法可操作性有待加強，細胞中蛋白本來就很少，一瓶50ml的細胞有時按照實驗要求只能加100-200l的裂解液，按照上述操作，直接用200l裂解液進行裂解，根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預冷的PBS（一般數(shù)毫升）加入后，用細胞刮刀刮下細胞，轉移至試管中，如果數(shù)瓶細胞是收集同一蛋白的，可以放在同一試管，離心后再將蛋白轉移到EP管中，這樣可操作性就比較強）（二） 組織中總蛋白的提?。?、將少量組織塊置于12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、加400l

21、 單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中進行勻漿。然后置于冰上。3、幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。4、裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20保存。(三) 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提?。?、將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。2、棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重

22、復洗滌一次。3、用槍吸干上清后，加100l裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20保存。二、蛋白含量的測定（一） 制作標準曲線1、從-20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標記為0g，2.5g，5.0g ，10.0g ，20.0g ，40.0g。3、按下表在各管中加入各種試劑。0g2.5g5.0g10.0g20.0g40.0g1mg/ml BSA2.5l5.0l10.0l20.0l40.0l

23、0.15mol/L NaCl100l97.5l95.0l90.0l80.0l60.0lG250考馬斯亮藍溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計上比色分析。（二） 檢測樣品蛋白含量1、取足量的1.5ml離心管，每管加入4儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。2、取一管考馬斯亮藍加0.15mol/L NaCl溶液100l，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。3、棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。4、取一管考馬斯亮藍加95l 0.

24、15mol/L NaCl NaCl溶液和5l待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結果是5l樣品含的蛋白量。三、SDSPAGE電泳1 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。2 灌膠與上樣（1）、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（可以用1%瓊脂糖在垂直電泳槽的左、右和下部封邊，五分鐘后重復一次，這樣可以保證基本不漏膠，但現(xiàn)

25、在的灌膠模具都不用了）（2）、按前面方法配10分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢，否則膠會被沖變型。）（3）、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。（4）、按前面方法配4的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣

26、泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠（其實說經(jīng)常有點過了，補1-2次就行了，不補膠問題也不大）。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（5）、用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中（沖洗的話個人感覺可以使用5ml的針筒，當然操作不能太粗暴了）。（6）、測完蛋白含量后，計算含20-50g 蛋白（根據(jù)自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量）的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至200l的EP管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15l，

27、加樣孔的最大限度可加20l樣品）（其實大一點的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達到40l，膠做得很好的話50l也是問題不大的）上樣前要將樣品于金屬浴中煮5-10min使蛋白變性（本人心得：煮完樣品后，樣品會蒸發(fā)到EP 管的頂部，一定用離心機把所有樣品離到管底）。（7）、加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次，以免交叉污染）3 電泳：電泳時間一般100min(Bio-Rad)，濃

28、縮膠電壓為80V較好，到分離膠以后用120跑（新鮮的電泳緩沖液當然跑得更快一些）。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜（如果目的條帶比較大的話，最好使用可視的蛋白marker，F(xiàn)ermentas的0441和0671比較好，就是有點貴。一般要讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好，不要局限于此說明）。四、轉膜1 轉一張膜需準備6張7.08.3cm的濾紙和1張7.38.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用（其實用無水甲醇完全浸濕，然后放到轉移緩沖液中浸泡后使用，效果也不錯）。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里

29、，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水）（個人感覺其實轉膜之前浸濕一下就ok了，沒有多大問題，可能按照上述操作結果會更好）2 在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。3 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上，注：個人感覺就墊1張濾紙也沒問題呀），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。4 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕

30、，要在兩個邊上輕輕的反復撬（應該邊撬邊用流水緩緩沖洗）。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上l 另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）（最后做成的“三明治”千萬不能形成短路，不然有可能

31、會短路燒壞轉膜裝置（價格不菲，尤其是進口的），第一次做的應請老手指教）。5 將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉移2 h或40V轉移3 h。（1.實際上應該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉膜時間，對于小分子量的蛋白，轉膜時最好墊兩塊硝纖膜，以免轉膜過頭，因為如果第一張膜上蛋白質已經(jīng)轉過了，第二張膜上還有蛋白質可以進行檢測；對于大分子量的蛋白，轉膜時電壓要高一點，一般80-100V，時間也要延長一點，開始最好也用兩塊膜，特別是務必注意加強降溫措施。當然轉膜是要摸條件的，最好剛開始做的時候摸個轉膜的時間梯度。如果由于時間原因來不及做下面實驗，可以在4度下12V轉膜過夜）（2.硝纖膜建議使用0.22 的小孔徑膜，不容易轉膜過頭）（