大白菜永久高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建

1、園 藝 學 報 2005, 32(2 :249255大白菜永久高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建張立陽 1, 2 張鳳蘭 13 王 美 1 劉秀村 1 趙岫云 1 薛林寶 2(1北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心 , 北京 100089; 2揚州大學農(nóng)學院園藝系 , 揚州 225009摘 要 :以大白菜高抗 Tu MV 白心株系 912112和高感 Tu MV 桔紅心株系 T12219為親本建立的小孢子培養(yǎng) DH 系作為圖譜構(gòu)建群體 , 構(gòu)建了包含 10個連鎖群 、 406個標記位點的分子連鎖圖譜 , 圖譜總長度82613c M , 標記間的平均圖距為 210c M , 連鎖群數(shù)目和染色體數(shù)相等 。 每個連鎖

2、群上的標記數(shù)在 7111個 之間 , 連鎖群的長度在 261415611c M 的范圍內(nèi) , 平均圖距在 110318c M 之間 。 該連鎖圖譜包括 246個AF LP 標記 、 135個 RAP D 標記 、 11個 SSR 標記和 12個同工酶標記 、 1個 SCAR 標記和 1個形態(tài)標記 。關(guān)鍵詞 :大白菜 ; 分子標記 ; 遺傳圖譜 ; DH 群體中圖分類號 :S 63413 文獻標識碼 :A 文章編號 :05132353X (2005 0220249207A L i n kage M ap Con structi on for Ch i n ese Cabbage Ba sed o

3、n AFL P, SSR, RAPD and Isozy m e M arkers Usi n g D H Popul a ti onZhang L iyang 1, 2, Zhang Fenglan 13, W ang Mei 1, L iu Xiucun 1, Zhao Xiuyun 1, and Xue L inbao 2(1N ational Engineering R esearch Center forV egetables, B eijing 100089, China; 2Horticultural D epart m ent, U niversi 2 ty, Yangzhou

4、 225009, China Abstract:A molecular genetic map f or Chinese lified Frag ment Length Poly mor phis m , RAP D (Si p le Sequence Repeat and is ozy me . was ly chosen DH lines obtained by m icr os pore 1w 912112and T12219. 406markers including 246AF LP D 11SSR markers, 12is ozy me markers, 1SCAR and 1m

5、or phol ogi 2 cal marker int o 10gr oup s using Join Map 310. It covered 82613c M with a mean marker inter 2 val of 210c M. Nu mber of markers included in linkage gr oup s varied fr om 7t o 111, mean marker interval dis 2 tance fr om 110c M t o 318c M and the length of linkage gr oup s fr om 2614c M

6、 t o 15611c M individually . A t otal of 4510%dist orted markers distributed in the map. The molecular genetic map constructed in this study would be useful in gene l ocalizati on, comparative genomes research and QT L mapp ing of i m portant agr onom ic traits for Chinese cabbage .Key words:Chinese

7、 cabbage; Molecular marker; Genetic linkage map; Double hap l oid (DH 大白菜 (B rassica cam pestris L. ss p. pekinensis 原產(chǎn)我國 , 是我國蔬菜栽培中分布最廣 、種植面 積最大的蔬菜作物之一 , 其遺傳學和分子生物學研究一直受到高度重視 。 分子連鎖圖譜為進行植物基 因組的結(jié)構(gòu)分析和比較提供了有力工具 。 較高密度的分子圖譜已有效的應用于數(shù)量性狀的基因定位 、 比較基因組學研究和分子標記輔助育種等研究中 。關(guān)于大白菜 (種 遺傳圖譜的構(gòu)建 , 國內(nèi)外先后 有 Song 等 1 、

8、Teut onico 等 2 、 A jisaka 等 3 、 Tanhuanpaa 等 4 、 Matsumot o 等 5 、張魯剛等 6 、于拴 倉等 7 報道 。 但上述研究主要存在 4個問題 :第一 , 使用的標記主要為 RF LP 和 RAP D 標記 。 RF LP 標記較為復雜 , 探針難以獲得 , 不易進行大量單株篩選 ; RAP D 標記雖易于操作 , 但其穩(wěn)定性較差 。 AF LP 技術(shù)結(jié)合了 RF LP 和 RAP D 的特點 , 穩(wěn)定性較好 , 在一次 PCR 反應中能同時檢測多個遺傳位點 , 收稿日期 :2004-06-02; 修回日期 :2004-10-16基金項

9、目 :北京市科技新星項目 (954812900 ; 國家 863 項目 (2001AA241124, 2002AA2070123通訊作者 Author f or corres pondence (E 2mail:zhangfenglannercv 1com 園 藝 學 報 32卷信息量非常豐富 。 SSR 標記所揭示的多態(tài)性也十分豐富 , 相對于 RAP D , 重復率和可信度高 , 逐漸成 為遺傳標記中的研究熱點 。 第二 , 目前構(gòu)建的遺傳圖譜大多利用亞種間雜交獲得的群體 , 對于指導育 種來說 , 選用品種間雜交組合更貼近育種目標 , 可以獲得許多重要農(nóng)藝性狀完整的遺傳信息 。第三 ,

10、圖譜的密度不高 , 目前大白菜品種間組合所獲得的圖譜標記密度低 , 尚不能滿足農(nóng)藝性狀定位和基因 組研究的要求 。 第四 , 大多數(shù)圖譜是利用 F2群體構(gòu)建的 , 為非永久性群體無法繼續(xù)將其飽和 , 很難 與其它實驗室合作進行比較研究 , 同時很難準確地對大白菜數(shù)量性狀進行定位 。 采用永久群體如 DH 群體與重組自交系進行分子圖譜的構(gòu)建已成為國際上的主流方向 。本研究對大白菜普通白心株系 912112和桔紅心株系 T12219雜交 F1進行游離小孢子培養(yǎng) , 以得到 的 100個 DH 株系為作圖群體 8 , 采用 AF LP 標記 、 SSR 標記 、 RAP D 標記 、 同工酶標記 、

11、 SCAR 和形 態(tài)標記等 , 構(gòu)建了永久高密度的大白菜分子連鎖圖譜 , 可為重要農(nóng)藝性狀的基因定位和標記輔助育種 研究參考 。1 材料和方法大白菜普通白心株系 912112為連續(xù)自交 9代的高代自交系 , 球心為白色 , 葉面較平 , 葉球疊抱 ,高抗蕪菁花葉病毒 (Tu MV 。 T12219是通過對北京地方品種和日本引進品種的雜種 F1進行小孢子培 養(yǎng)得到的雙單倍體株系 , 球心為桔紅色 , 植株生長勢弱 , 高感蕪菁花葉病毒 。 對 912112和 T12219的 F 1進行小孢子培養(yǎng) , 得到 100個雙單倍體株系 , 作為白菜構(gòu)建連鎖圖譜的分離群體 。采用 CT AB 法提取基因組

12、 DNA, 按 Murry 等 9 的方法進行 10 的 方法 。參照 Vos 的方法 11 進行 AF LP 分析 , AF LP 2BRL劑盒說明書進行 , 稍有改動 , 反應體積減半 。 DNA i o 2Rad, America 上分離 , 。RAP D L 0L 25mmol/LMgCl 2, 210L 215mmol/L d NTP, 1U , ng , 50ng 模板 DNA 。熱循環(huán)程序為 :94 預變性 4m in, 然后 94 15s, 3730s, 72 75s 下循環(huán) 45次 , 72 延伸 7m in 后保存在 4 條件下 。 采用 114%瓊脂 糖 (含 015mg

13、 /LEB 凝膠 , 80V 電泳 2h 。 用 Kodak EDAS 2120凝膠成像系統(tǒng)照相分析 。SSR 引物序列參照 Sze wc 等 12 引物序列由 Sangon 公司合成 。 20L 反應體系含有 1PCR buffer, 31125mmol/LMgCl 2, 0125mmol/LdNTPs, 110mol/L引物 , 30ng 模板 DNA , 1U TaqE 。 反應程序 為 :94 預變性 2m in, 94 變性 60s, 68 退火 30s, 72 延伸 45s, 進行 2個循環(huán) , 以后每 2個循 環(huán)降低退火溫度 1 直到 58 , 最后 94 變性 60s, 58

14、退火 30s, 72 延伸 45s 進行 20個循環(huán) 。 擴增產(chǎn)物用 6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 , 55W 預電泳 1h 后 , 60W 電泳約 115h, 直至二甲苯青 跑到膠的 2/3處為止 , 停止電泳 , 進行銀染分析 。同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳 , 凝膠制備參照周順伍的 13 的方法 , 分離膠的濃度 是 7%, 濃縮膠濃度是 3%, 在 4 條件下 300V 恒壓電泳 。 染色參照王中仁 10 的方法進行 。用 10%的甘油制成干膠保存或照相記錄電泳結(jié)果 。數(shù)據(jù)整理將各個株系的帶型按親本類型分類 , 與 912112帶型相同者賦值為 A, 與 T12219帶型相

15、同者賦值為 B , 由各種原因造成的數(shù)據(jù)不清或缺失者賦值為 “ -” 。 根據(jù)與 100bp DNA ladder 標準譜 帶的相對位置 , 估計多態(tài)性條帶的分子量大小 。 RAP D 和 SSR 標記名稱用引物名稱加擴增片段的堿基 長度表示 , 由于 AF LP 采用的是 (E +A /(M +C 組合 , 所以 AF LP 標記用引物中后兩個選擇性堿 基組合加擴增片段大小表示 。 兩個選擇性堿基組合之間用 “ -” 分開 。連鎖分析利用 Join Map 310 14, 15 軟件構(gòu)建大白菜遺傳圖譜 。先用 “ Ne w p r oject ” 命令創(chuàng)建一個新 的文件 , 用 “ Load

16、 data ” 命令導入數(shù)據(jù) ; 然后 , 在 “ I ndividual genot . freq ” 下排除缺失數(shù)據(jù)過多的 052 2期 張立陽等 :大白菜永久高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建 單株 , 在 “ Locus genot . freq ”下分析標記的偏分離情況 ; 最后將 LOD 值的范圍設(shè)定為 “ 2”到 “ 10” , 用 “ Gr oup ” 命令進行分組 ; 選用 “ Kosa mbi ” 函數(shù)計算圖距 , 用 “ Map ” 命令構(gòu)建連鎖圖譜 。2 結(jié)果與分析211 分子標記多態(tài)性利用親本與 F1代進行 AF LP 引物組合的篩選 , 最后從 64對引物中篩選出 20對條帶

17、清晰 、 多態(tài)性 高的引物組合進行 AF LP 分析 。 20對引物共產(chǎn)生 810個條帶 , 平均每個引物擴增出 4015條帶 。 810個位點中 263個位點在雙親間具有多態(tài)性 , 占 3215%。 263個多態(tài)性位點中有 26個標記為共顯性標 記 , 占 919%。對 462個 RAP D 引物進行分析 , 篩選出在雙親間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)的引物 99個 。其共產(chǎn)生 406條擴 增譜帶 , 平均每個引物擴增 411條帶 , 其中多態(tài)性譜帶 150條 , 占 3215%。 150個多態(tài)位點中有 2個 共顯性標記 , 占 113%。對 15個 SSR 引物對進行分析 , 其中 6對引物產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物

18、多態(tài)性明顯 , 帶型清晰且穩(wěn)定性好 。 6對 SSR 引物共產(chǎn)生 17個多態(tài)性位點 , 多態(tài)率為 218條 /引物對 。通過對天 冬 氨 酸 轉(zhuǎn) 氨 酶 (AAT 、蘋 果 酸 脫 氫 酶 (MDH 、蘋 果 酸 酶 (ME 、乳 酸 脫 氫 酶 (LDH 、 磷酸葡萄糖變位酶 (PG M 、甲酸脫氫酶 (F DH 、谷氨酸脫氫酶 (G DH 7種同工酶進行 電泳分析 , 得到在雙親間表現(xiàn)差異的譜帶 14條 , 其中共顯性標記 10個 , 占 7114%。212 遺傳圖譜的構(gòu)建對 446個多態(tài)性標記進行分析構(gòu)圖 , 得到包含 406、 10(圖 1, 表 1 , 其中包括 246個 AF LP

19、 標記 , 135個 RAP D 標記 , 11個 12SCAR 標記和 1個形態(tài)標記 。 總長度為 82613c M , 111個之間 , 連鎖群的長度在 26141561, 101之間 。 406個分子標記中 , 來自父本的標記為 222個 , 占 54184個 , 占 4513%, 符合 1 1的理論分離比 。 各位點上 , 912112的 基因頻率 為 796%2317%, 平 均 為 51165%; T12219的 基 因 頻 率 為 2014%7613%, 平 均 為 48135%。 所以 , 親本在群體中的分離比例接近 , 說明該群體總體上沒有出現(xiàn)嚴重的偏分離 。試驗分析的 44

20、6個標記中 , 有 910%的標記未進入連鎖群 , 包括 17個 AF LP 標記 、 15個 RAP D 標 記 、 6個 SSR 標記和 2個同工酶標記 (表 1 。 10個連鎖群中 , LG1包含的標記最多 , 有 111個 , LG8最少 , 只有 7個 。 標記在 LG1、 LG4和 LG5上的分布不均勻 , 分別出現(xiàn)不同程度的標記密集區(qū) , 尤其 是 AF LP 標記 ; 其余連鎖群上的標記分布比較均勻 , 只有 03個間距大于 10c M 的空隙 。 LG8的平均 圖距最大 , 為 3177c M; LG6的平均圖距最小 , 為 110c M (表 2 。表 1 構(gòu)建遺傳圖譜的分

21、子標記Table 1 M olecul ar markers used for geneti c map con structi on分子標記 Molecular marker 多態(tài)性標記數(shù) /引物對Number of poly mor phicmarkers/pri m ercombinati on偏分離標記數(shù)Number ofdist ortedmarkers偏分離標記比率Rate of dist ortedmarkers (%連鎖標記數(shù)Numberof linkedmarkers未連鎖標記數(shù)Number ofunlinked markers未連鎖標記比例 Rate of unlinked

22、 markers (%SSR 17/6 654151163513SCAR 1/- 00 100形態(tài)標記 Mor phol ogical marker 1/- 00 100152 園 藝 學 報 32 卷 252 2期張立陽等 :大白菜永久高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建 圖 1 用 D H 群體構(gòu)建的大白菜分子連鎖圖“ 3” 和 “ 33” 表示標記的分離偏離理論分離比例 1 1, 3:P 005, 33:P 0101。F i g . 1 The li n kage map con structed w ith D H ti on i n i n ese 3 and 33 indicate marke

23、rs showing deviati ons fr om the expected 1 1o, 3:0105, :0213 偏分離分析在 , 即表現(xiàn) ; 在 水平上有 70個位點偏離孟德爾分離比例 , 即表現(xiàn)顯著偏分離 , 比率為 1713%, 偏向 912112者占 6615%, 偏向 T12219者占 3315%。從偏分 離位點的分布來看 , 除了 LG10沒有偏分離位點外 , 其余均有 , 其中 LG2、 LG3和 LG6均為偏分離標 記 。 大部分偏分離標記在連鎖群上表現(xiàn)為多個位點集中分布 , 如 LG9的兩端 , LG7的下半部分 。 LG2、 LG3、 LG8和 LG9上的偏分離標

24、記全部偏向 912112, LG6上的偏分離標記全部偏向 T12219, 其余連鎖群中除了 LG10外 , 大部分偏向 912112(表 1、 表 2 。表 2 分子標記在遺傳圖譜上的分布Table 2 D istr i buti on of m olecul ar markers on li n kage map連鎖群L inkage gr oup LOD 值LOD score長度 Length(c M 標記數(shù)Number of markers 平均距離Average distance (c M 偏 T12219標記數(shù)Number of markers dist orted t o T122

25、19偏 91212標記數(shù)Number of markersdist orted t o 91212偏分離標記數(shù)Number of dist orted32LG77102194221522224LG842614 73180 5 5LG9377183621201919LG1095812202190 0 0總計 Total-8261340621061121182352 254 園 藝 學 報 32 卷 3 討論 本研究主要利用 AFLP、 RAPD、 SSR 和同工酶標記構(gòu)建大白菜連鎖圖譜 , 由結(jié)果可知多態(tài)性檢出 效率 : AFLP SSR RAPD。說明 AFLP是一種多態(tài)性豐富 , 高通量的分

26、子標記類型 , 對于構(gòu)建圖譜 和增加圖譜密度是高效的 。這與 M cGregor 16 的試驗結(jié)果一致 。 外 , 尚與所用材料和群體的種類有關(guān) 。構(gòu)建的遺傳圖譜大小與作圖群體雙親間遺傳差異的大小密切相 關(guān) , 當雙親間遺傳距離大 , 差異位點多 , 且在染色體上分布均勻時 , 構(gòu)建的遺傳圖譜較長 , 也更接近 基因組實際 。本研究中采用 91 2 和 T12 2 兩個大白菜品種間雜交產(chǎn)生的 DH 群體為作圖群體 , 是 112 19 導致覆蓋基因組較小的原因之一 。此外 , 由于本研究中的主要標記為 EcoR I2 se I AFLP 標記 , 其在染 M 色體上的簇狀排列可能是導致基因組覆

27、蓋面積小的又一原因 。 EcoR I2 se I AFLP 標記檢測的位點多聚 M 集在著絲粒兩側(cè)甲基化較高的重復序列區(qū)域 , 標記聚集而形成 “ ” 這種現(xiàn)象可能與異染色質(zhì)區(qū)重 簇 , 組率低有關(guān) 。該缺陷可以利用不同分子標記特性的互補來彌補 , 如 Pst I2 se I AFLP 標記 , Pst I可以在 M 非甲基化的常染色質(zhì)區(qū)識別酶切位點 , 另外在連鎖圖中增加 RFLP標記可以增加標記在染色體上分布 的均勻性和圖譜的穩(wěn)定性 。 本研究 中 偏 分 離 標 記 的 頻 率 ( 4510% 比 蕓 薹 屬 其 他 研 究 ( Teutonico 等 , 23% ; Chyi 等 ,

28、24% 17 2, 中的頻率高 。異常分離現(xiàn)象在自然界中普遍存在 , 在遠緣雜交組合的分離群體及 DH 和 R I 群體中尤為明顯 。導致偏分離現(xiàn)象的原因很多 , 主要有 : ( 1 由配子體或孢子體不同發(fā)育階段基因 型的選擇所造成 。A jisaka等 18 與 RAPD 標記分離相關(guān)性進行研究 。結(jié)果表明 , 多數(shù) RAPD 標記出現(xiàn)偏分離頻率與胚狀體發(fā)生能力成 正相關(guān) , 這從一個側(cè)面證實了配子體或合子的選擇性是形成偏分離的主要原因 。 ( 2 由小孢子培養(yǎng) 和植株再生過程的選擇壓造成 。DH 群體來自雄配子體的花粉培養(yǎng) , 花粉培養(yǎng)導致的偏分離可能偏向 22 19, 高花粉培養(yǎng)反應能力

29、的親本 , 這在玉米和白菜的 DH 群體中已有報道 。 ( 3 由于遺傳搭車效應 , 與影響偏分離的遺傳因子緊密連鎖的分子標記表現(xiàn)為嚴重的偏分離 。 ( 4 與 F2群體相比 , DH 群體中 隱性有害基因的選擇壓增大 , 很可能導致偏分離的發(fā)生 。此外 , 環(huán)境因素和群體的隨機效應也會引起 偏分離 。對蕓薹屬作物曾有偏分離標記集中分布于某幾個連鎖群的特定區(qū)域內(nèi) , 并明顯偏向某一親本 型的研究報道 20 偏分離標記全部偏向 T12 2 19, 該結(jié)果與 Moriguch 參考文獻 : 鎖圖譜 , “ ap ”命令對每個連鎖群根據(jù)標記間連鎖的緊密程度進行 1 3 次不等的標記添加 , 對于含

30、M 有較多偏分離標記的連鎖群不宜采用經(jīng)過 3 次添加才構(gòu)成的 , 以選取第 2 次添加后所得的連鎖群為 宜 , 這樣既可避免丟失有效標記 , 又可避免由于過多添加偏分離標記導致連鎖圖失去真實性 。 綜上所述 , 對于具有重要經(jīng)濟價值的大白菜來說 , 構(gòu)建一張永久高密度的遺傳連鎖圖具有重要的 意義 。本研究采用永久群體 (雙單倍體群體 、利用 AFLP、 RAPD、 SSR 和同工酶等多種分子標記構(gòu) 建了高密度大白菜分子遺傳圖譜 , 標記間的平均距離只有 210 cM , 可為今后進行白菜重要性狀精細 的 QTL (數(shù)量性狀位點 定位作參考 。 fragment length polymorph

31、ism loci Theor App l Genet , 1991, 82: 296 304 . . . . oleracea and A rabidopsis tha liana. Theor App l Genet , 1994, 89: 885 894 . . . 1 ( 1850 cM , 280 個標記 和 本研究所得到的大白菜遺傳圖譜總長度為 82613 cM , 約為 Song等 2 ( 1785 cM , 139 個標記 所構(gòu)建圖譜的 1 /2。筆者認為圖譜大小除與基因組大小有關(guān) Teutonico 等 1 Song K M , Suzuki J Y, Solcum M K,

32、W illiovm s P H, O sborn T C. A linkage map of B rassica rapa ( syn. cam pestris based on restriction 2 Teutonico R A , O sborn T C. Mapp ing of RFLP and qualitative trait loci in B rassica rapa and comparison to the linkage map s of B. napus, B. 3 A jisaka H, Kuginuki Y, H ida K, Enomoto S, H irai

33、M. A linkage map of DNA markers in B rassica cam pestris. B reed. Sci , 1995, 45 . 。本研究中 , LG2、LG3、LG8 和 LG9 上的偏分離標記全部偏向 91 2 112, LG6 上的 21 曾對 B 1 cam pestris的游離小孢子培養(yǎng)過程中 F2代單株胚狀體發(fā)生能力 的研究結(jié)果相似 。利用 JoinM ap 310 中軟件構(gòu)建連 2 期 ( Supp l : 195 . 張立陽等 : 大白菜永久高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建 255 10 王中仁 . 植物等位酶分析 . 北京 : 科學出版社 , 19

34、96. 82 85, 91 102 11 Vos P, Hogers R, B leckerM , R igansM , Lee T, HornesM , FritersA , Pot J, Peleman J, KniperM , Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerp rinting Nucl Acids Res , 1995, 23: 4407 4414 . . . 12 Szewc2 cFadden A K, Kresovich S, B liek S M , M itchell S E, Mcferson J R. Identi

35、fication of polymorphic, conserved simp le sequence re2 W peats ( SSR s in cultivated B rassica species Theor App l Genet , 1996, 93: 534 538 . . . . 13 周順伍 . 基礎(chǔ)生化試驗技術(shù) . 北京 : 北京農(nóng)業(yè)大學出版社 , 1989. 100 200 Zhou S W. B iochem ical experim ental techniques Beijing: Beijing Agricultural University Press, 19

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37、DLO , W agerningen, The 16 McGregor C E, Lambert C A , Greyling M M , Louw J H , W arnich L. A comparative assessment of DNA fingerp rinting techniques ( RAPD , ISSR, AFLP and SSR in tetrap loid potato ( Solanum tuberosum L. germp lasm. Euphytica, 2000, 113: 135 144 17 Chyi Y S A genetic linkage map

38、 of restriction fragment length polymorphis loci for B rassica rapa ( syn. cam pestris . Genome, 1992, 35: . m 746 757 18 A jisaka H, Kuginuki Y, ShiratoriM , Ishiguro K, Enomoto S, H iraiM. Mapp ing of loci affecting the cultural efficiency of m icrospore culture of B rassica rapa L. syn. cam pestr

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40、 hitehead Institute Technical Report, . 2nd ed. 1993, 1 100 acea. B reeding Science, 1999, 49 ( 4 : 257 265 21 Moriguch K A genetic map based on RAPD , RFLP, isozyme morphological markers and QTL analysis for clubroot resistance in B rassica oler2 . 22 Zhang F L, Aoki S, Takahata Y RAPD markers linked to m icrospore embryogenic ability in B rassica crop s Euphytica, 2003,