聚乙二醇修飾的膽固醇酯酶在高密度脂蛋白膽固醇均相測(cè)定中的作用

1、聚乙二醇修飾的膽固醇酯酶在高密度脂蛋白膽固醇均相測(cè)定中的作用                        【摘要】  目的：對(duì)膽固醇酯酶進(jìn)行修飾，評(píng)價(jià)修飾酶的反應(yīng)選擇性。方法：采用各種聚乙二醇修飾劑對(duì)膽固醇酯酶進(jìn)行修飾從而獲得一系列修飾酶，然后研究這些修飾酶在高密度脂蛋白膽固醇的臨床檢驗(yàn)中的作用。結(jié)果：經(jīng)雙臂聚乙二醇修飾劑修飾的酶比用其他修飾劑修

2、飾的酶具有更好的熱穩(wěn)定性和更高的酶活性，且表現(xiàn)出了較高的對(duì)高密度脂蛋白膽固醇的反應(yīng)選擇性。結(jié)論：表面活性劑對(duì)高密度脂蛋白的選擇性解離作用非常重要，這有助于修飾酶發(fā)揮其對(duì)高密度脂蛋白膽固醇的反應(yīng)選擇性。 【關(guān)鍵詞】  聚乙二醇修飾酶 膽固醇酯酶 高密度脂蛋白 解離劑的選擇性    眾多流行病學(xué)與臨床研究證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化（AS）、冠心病（CHD）的發(fā)生率與血清高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）水平呈負(fù)相關(guān)，而與低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）水平呈正相關(guān)?？焖贉?zhǔn)確地測(cè)定血清中的HDLC與LDLC水平對(duì)臨床診斷意義重大13。高密度脂蛋白膽固醇均相測(cè)定法（HDLC

3、homogeneous methods）通稱直接法（direct method），由于樣品不需預(yù)處理，可用自動(dòng)分析儀檢測(cè)，適合于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查及工作量大的實(shí)驗(yàn)室使用，具有標(biāo)本用量少、快速、簡(jiǎn)便、精密度高等優(yōu)點(diǎn)4。Sugiuchi等5研制出的聚乙二醇修飾酶法（PEGME法）測(cè)定HDLC是一種重要的均相測(cè)定方法，具有線性關(guān)系好、抗干擾能力高、特異性好等優(yōu)點(diǎn) 67，現(xiàn)已廣泛用于臨床檢驗(yàn)。該方法利用膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶經(jīng)過(guò)PEG6000修飾后而引起酶的變構(gòu)，變構(gòu)酶對(duì)脂蛋白的大小和（或）電荷具有選擇性，其反應(yīng)選擇性依次為高密度脂蛋白(HDL)>乳糜微粒（CM）>極低密度脂蛋白（VLD

4、L）>低密度脂蛋白（LDL）,從而達(dá)到檢測(cè)HDLC的目的5。本研究借鑒目前流行的蛋白質(zhì)聚乙二醇化學(xué)修飾技術(shù)89，首先合成了一系列聚乙二醇類(lèi)修飾劑，然后對(duì)膽固醇酯酶進(jìn)行修飾并獲得各種修飾酶，研究這些修飾酶的酶學(xué)性質(zhì)，評(píng)價(jià)各種不同結(jié)構(gòu)的修飾酶對(duì)高、低密度脂蛋白的反應(yīng)選擇性。    1  材料與方法    1.1  試劑與儀器    膽固醇酯酶（CHER，190 U·mg-1）購(gòu)于日本Asahi kasei公司；膽固醇氧化酶（CHOD，24 U·mg-1）購(gòu)于日本T

5、oyobo公司;辣根過(guò)氧化物酶（POD，250 U·mg-1）購(gòu)于華美生物工程公司;4氨基安替比林(4AA)、N(2羥基3丙磺?；?3,5二甲基苯胺鈉鹽(HDAOS)、膽固醇乙酸酯、2,4,6三硝基苯磺酸鈉（TNBS）、單甲氧基聚乙二醇(mPEG，相對(duì)分子質(zhì)量2000、5000）、聚乙二醇(PEG，相對(duì)分子質(zhì)量4000、6000、20000）均購(gòu)于Sigma公司；TritonX100購(gòu)于上海伯奧生物科技公司(美國(guó)進(jìn)口分裝)；硫酸環(huán)糊精（SCD）自制10；超速離心所得HDL及LDL純品由南京軍區(qū)總醫(yī)院捐贈(zèng)。    紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Cary 100 Bi

6、o UV Spectrophotometry,Varian），紅外光譜儀(TENSOR 27,Bruker)，核磁共振儀（300 MHz,Bruker），pH計(jì)（PB10,Sartorius）。    按照Leonard等1112所述方法合成修飾劑，用N羥基琥珀酰胺和二環(huán)己基碳二亞胺活化，合成mPEG2000NHS、PEG4000NHS、mPEG5000NHS、PEG6000NHS和PEG20000NHS單臂聚乙二醇修飾劑，修飾劑結(jié)構(gòu)如圖1A所示。按照文獻(xiàn)1314介紹的方法合成2mPEG2000LysNHS、mPEG5000+ 2000LysNHS以及2mPEG5

7、000LysNHS雙臂聚乙二醇修飾劑，修飾劑結(jié)構(gòu)如圖1B所示。    1.2  膽固醇酯酶的修飾    稱取一定比例的修飾劑及原酶，分別溶解在0.2 ml磷酸緩沖液（pH 9.3,0.1 mol·L-1）中。將修飾劑溶液分3次在20 min內(nèi)加入原酶試劑中，每次混合均勻，隨后放入4  冰箱中過(guò)夜。第2天在4 下透析，透析液采用Na2HPO4NaH2PO4 緩沖液（0.1  mol·L-1，pH 8.5）。CHER濃度測(cè)定采用紫外雙波長(zhǎng)法。    1.3&#

8、160; 修飾酶修飾化度的測(cè)定    采用TNBS法1516測(cè)定修飾酶的修飾化度，原理是利用2，4，63硝基苯磺酸(TNBS)能與蛋白中賴氨酸殘基上的氨基進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行分析。    1.4  修飾酶的活力測(cè)定17    原理如圖 2所示，CHER將膽固醇乙酸酯水解為游離膽固醇，后者被CHOD氧化成4膽甾烯酮并產(chǎn)生過(guò)氧化氫,再經(jīng)過(guò)氧化物酶(POD)催化,與助色劑4氨基安替比林(4AA)和顯色劑N(2羥基3丙磺酰基)3,5二甲基苯胺鈉鹽(HDAOS)作用,生成藍(lán)色醌亞胺色

9、素。醌亞胺的最大吸收在600 nm左右,吸光度值的變化與CHER的活力成正比。    1.4.1  顯色劑溶液  0.1 mg POD，5 mg 4AA溶于10 ml TrisHCl 緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）。    1.4.2  底物溶液  稱取25 mg膽固醇乙酸酯溶于2 ml Triton X100，加熱至完全溶解且溶液澄清，再加入18 ml pH 7.0磷酸緩沖液。    1.4.3  原酶反應(yīng)液  5 m

10、l TrisHCl 緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）中溶有CHER 0.016 g·L-1,CHOD 0.016 g·L-1,HDAOS 0.75 g·L-1。    1.4.4  修飾酶反應(yīng)液  5 ml TrisHCl 緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）中溶有PEGCHER 0.016 g·L-1,CHOD 0.016 g·L-1,HDAOS 0.75 g·L-1。    1.4.5  活力測(cè)定&

11、#160; 取原酶反應(yīng)液0.4 ml 37 溫育2 min，分別加入底物0.1 ml，37 再溫育5 min，加入顯色劑0.3 ml，600 nm處測(cè)得吸光度A1、A1；修飾酶的活力測(cè)定同原酶，測(cè)得吸光度A2、A2。（A2-A1）/(A2-A1)即為修飾酶的活力殘余。    1.5  修飾酶對(duì)HDL反應(yīng)選擇性的評(píng)價(jià)方法       試劑R1：SCD（1.15 g·L-1）,無(wú)水MgSO4（0.2 g·L-1）,HDAOS（0.3 g·L-1）溶于Na2HPO4NaH

12、2PO4 緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）；試劑R2：PEGCHER（1.2 kU·L-1），CHOD（6 kU·L-1），POD（30 kU·L-1）,4AA（0.5 g·L-1）,解離劑（0.01 0.16 kg·L-1），溶于Na2HPO4NaH2PO4 緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 7.0）。    檢測(cè)樣品為超速離心所得HDL（1 mg·dl-1）及LDL（1.2 mg·dl-1），所用酶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖 3。測(cè)定過(guò)程為：取0.6 ml R1加入

13、8 l 樣品（HDL或LDL），37 溫育5 min后600 nm處測(cè)吸光度A0，加入0.2 ml R2，37 恒溫反應(yīng)每分鐘測(cè)1次A600 nm，7 min后停止反應(yīng)；計(jì)算光吸收變化值A(chǔ)。    以表面活性劑Triton X100（0.16 kg·L-1）為強(qiáng)解離劑,使用未修飾膽固醇酯酶（1.2 kU·L-1）時(shí)所測(cè)得的A作為100%解離HDL/LDL，計(jì)算出各種修飾酶對(duì)HDL及LDL的解離程度。    1.6  修飾酶的熱穩(wěn)定性    將修飾酶溶液用磷酸鈉緩沖溶液（0.0

14、5 mol·L-1，pH 7.0）稀釋至0.25 mg·ml-1，于37 恒溫培養(yǎng)箱中恒溫一定時(shí)間，取出后以膽固醇乙酸酯為底物測(cè)定酶活力，可以得到相對(duì)酶活力與時(shí)間的關(guān)系。    1.7  酶及修飾酶Km值的測(cè)定    米氏常數(shù)Km值的測(cè)定采用雙倒數(shù)作圖法（LineweaverBurk法）18。    2  結(jié)    果    2.1  修飾酶的活性變化    膽固醇酯

15、酶在不同比例的不同結(jié)構(gòu)的修飾劑作用下，其修飾酶的修飾化度有較大的差別，低分子質(zhì)量的單臂修飾劑（PEG4000或mPEG2000）在較低的比例下就可以取得較高的修飾化度，但雙臂修飾劑（2mPEG或mPEG50002000）和高分子質(zhì)量的PEG20000NHS修飾后的修飾酶修飾化度較低，酶活力損失較少，這可能是由于PEG20000NHS的分子質(zhì)量較大，而雙臂修飾劑的立體構(gòu)型類(lèi)似于傘形，它們與酶反應(yīng)的空間位阻較大，僅僅能與酶分子表面的賴氨酸殘基反應(yīng)，因此反應(yīng)較難發(fā)生，而且修飾化度低往往酶活力損失較小,這與其他研究組關(guān)于聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的研究結(jié)果1920一致。我們以雙臂的mPEG7000LysNHS

16、和mPEG5000NHS為例進(jìn)一步研究了修飾劑與酶的質(zhì)量比、修飾化度和酶活力的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著加入修飾劑的比例提高，修飾酶的修飾化度隨之增加，而修飾酶的活力隨之降低。相同質(zhì)量比的雙臂修飾劑與單臂修飾劑相比，單臂修飾劑修飾后的修飾化度比雙臂高；而相同修飾化度的修飾酶，經(jīng)雙臂修飾的保存活力明顯比經(jīng)單臂修飾多。見(jiàn)表1、2。表 1  PEG化膽固醇酯酶的活力和其對(duì)HDLC 和 LDLC的反應(yīng)活性注：括號(hào)內(nèi)為酶與PEG類(lèi)修飾劑的比值；DHDL為HDL的解離度，DLDL為L(zhǎng)DL的解離度注：括號(hào)內(nèi)為酶與PEG類(lèi)修飾劑的比值；DHDL為HDL的解離度，DLDL為L(zhǎng)DL的解離度；解離劑為0.16 g

17、·ml-1AEO10    2.2  修飾酶的Km值變化    在本實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得原酶的Km值(×10-3)為0.586,其余幾種修飾酶中僅有CHER2mPEG2000、CHERmPEG7000和CHER2mPEG5000 3種經(jīng)雙臂PEG修飾后的修飾酶的Km較接近于原酶，分別為0.740、0.926和0.830,即能在很大程度上保持修飾酶對(duì)底物的親和力。這可能是因?yàn)殡p臂PEG特殊的結(jié)構(gòu)使得修飾劑分子無(wú)法與酶分子活性位點(diǎn)的賴氨酸殘基接觸，不會(huì)影響酶對(duì)底物的特異性結(jié)合。其余5種修飾酶的Km值均有大幅提高，即

18、表明這幾種修飾酶對(duì)底物的表觀親和力減小，其中經(jīng)PEG20000修飾后修飾酶的Km最大(3.3)，可能是因?yàn)閱伪跴EG會(huì)與酶活性位點(diǎn)賴氨酸殘基結(jié)合，影響酶對(duì)底物的特異性結(jié)合，而雙端羥基PEG(包括PEG4000、PEG6000和PEG20000)除此之外可能還會(huì)與酶分子發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而改變酶分子的空間結(jié)構(gòu)，降低了酶對(duì)底物的特異性結(jié)合能力。                       

19、;          2.3  修飾酶的熱穩(wěn)定性    修飾酶的熱穩(wěn)定性較原酶有所增強(qiáng)，除PEG20000外，其余7種PEG修飾劑修飾膽固醇酯酶后均使其熱穩(wěn)定性略有改善，其中雙臂PEG的修飾效果較好。2mPEG2000LysNHS、2mPEG5000Lys和mPEG7000Lys在37 恒溫82 h后仍能保持最初活性的27.4%、30.9%和35.5%，而原酶和經(jīng)PEG20000修飾的酶經(jīng)相同時(shí)間后只能保持最初酶活性的16.4%和16.1%。  

20、  3  討    論    當(dāng)不使用表面活性劑解離脂蛋白時(shí)，未修飾酶沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)HDLC或LDLC的反應(yīng)活性，當(dāng)然修飾酶也沒(méi)有活性（表1）。當(dāng)所使用的AEO9（脂肪醇與環(huán)氧乙烷縮合物類(lèi)表面活性劑）對(duì)HDL和LDL沒(méi)有選擇性解離作用時(shí)，修飾酶也沒(méi)有表現(xiàn)出選擇性，這說(shuō)明解離劑解離脂蛋白是整個(gè)酶聯(lián)反應(yīng)的前提，解離劑所表現(xiàn)出的對(duì)脂蛋白的選擇性解離作用十分重要。事實(shí)上，HDLC的直接測(cè)定法中的聚陰離子多聚物/表面活性劑（polyanion polymer/detergent,PPD）法21就是利用表面活性劑對(duì)HDL的選擇性

21、解離作用完成測(cè)定工作的，但該方法（PPD法）試劑對(duì)HDL的作用相對(duì)緩慢且對(duì)LDL具有比較明顯的非特異性反應(yīng)（至少不低于10，甚至達(dá)到20），所以影響結(jié)果的準(zhǔn)確性7。因此，我們對(duì)市面所售表面活性劑進(jìn)行了篩選發(fā)現(xiàn)，HLB (親水親油平衡)值在10 13的非離子表面活性劑能很好地解離脂蛋白，將使其中的膽固醇酯釋放出來(lái)參與反應(yīng)。其中以烷基酚與環(huán)氧乙烷縮合物類(lèi)表面活性劑解離速度最快，但無(wú)特異性；HLB在12.5 13的脂肪醇與環(huán)氧乙烷縮合物類(lèi)表面活性劑表現(xiàn)出對(duì)HDL有一定的選擇性解離作用；不同類(lèi)的表面活性劑解離作用差異很大，且與其加入濃度有很大關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)隨著所加濃度的降低，對(duì)HDL與LDL的解離度也

22、呈下降的趨勢(shì)（膽酸鈉除外），但兩者的降低速度有差異，這就在一定的濃度區(qū)間內(nèi)形成了選擇性。表3顯示AEO10（脂肪醇與環(huán)氧乙烷縮合物類(lèi)表面活性劑）在0.001 0.1 g·ml-1時(shí)表現(xiàn)出對(duì)HDL有一定的選擇性解離，而APG（烷基糖苷類(lèi)）在0.000 2 0.01 g·ml-1時(shí)表現(xiàn)出對(duì)LDL一定的選擇性解離。以AEO10為解離劑對(duì)單臂mPEG5000及雙臂mPEG5000+2000LysNHS不同修飾化度的修飾酶進(jìn)行研究，部分結(jié)果列入表2。由表2可以看出選用合適的解離劑時(shí)，經(jīng)雙臂修飾劑修飾后的膽固醇酯酶在一定的修飾度時(shí)可提高對(duì)HDL的選擇性解離。這說(shuō)明修飾酶的選擇性是建立在

23、解離劑的選擇性基礎(chǔ)上的，修飾酶可以提高表面活性劑的選擇性。雙臂修飾劑由于其特殊的枝型尾部結(jié)構(gòu)使其空間位阻加大，只能對(duì)膽固醇酯酶的表面賴氨酸進(jìn)行修飾，所以經(jīng)其修飾的酶活力損失較單臂少，同時(shí)由于其特殊結(jié)構(gòu)經(jīng)其修飾的膽固醇酯酶所表現(xiàn)出的選擇性明顯比單臂好,在酶修飾技術(shù)上有很好的應(yīng)用前景。由表4可以看到mPEG5000CHER (修飾度38%)在AEO10質(zhì)量濃度為0.08 g·ml-1對(duì)HDL的選擇性最好，但此時(shí)的酶活性低于mPEG7000CHER (修飾度27.3%，表2），所以綜合考慮在本實(shí)驗(yàn)條件下，mPEG7000CHER (修飾度27.3%)在AEO10質(zhì)量濃度為0.16 g

24、83;ml-1對(duì)HDL的選擇性為最終優(yōu)化結(jié)果。表 3  表面活性劑濃度對(duì)其解離HDL/LDL選擇性的影響注：DHDL為HDL的解離度，DLDL為L(zhǎng)DL的解離度表 4  AEO10的濃度對(duì)PEG化的膽固醇酯酶對(duì)HDL/LDL的反應(yīng)選擇性的影響注：DHDL為HDL的解離度，DLDL為L(zhǎng)DL的解離度    表面活性劑的選擇性形成可能是由于不同脂蛋白膜上的載脂蛋白親水親油性質(zhì)的不同造成的。Sugiuchi等5認(rèn)為,膽固醇酯酶經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾后由于其接上的親水長(zhǎng)鏈能識(shí)別表面帶有親水性較強(qiáng)的載脂蛋白apoA的HDL。我們認(rèn)為,也有可能是由于其帶的親水長(zhǎng)鏈?zhǔn)?/p>

25、其與脂蛋白隔有一段空間距離，從而只能優(yōu)先與被表面活性劑破壞的脂蛋白中釋放出來(lái)的膽固醇酯進(jìn)行反應(yīng)，最后促進(jìn)了表面活性劑的選擇性。解離劑才是選擇性的提供主體，因?yàn)檎墙怆x劑破壞脂蛋白的膜層迫使其中的膽固醇酯被釋放出來(lái)與膽固醇酯酶進(jìn)行反應(yīng)。因此我們認(rèn)為，聚乙二醇化的膽固醇酯酶與高密度脂蛋白膽固醇的反應(yīng)可分為2個(gè)協(xié)同步驟：首先高密度脂蛋白膽固醇被表面活性劑選擇性地解離，由于經(jīng)聚乙二醇化的膽固醇酯酶的親水性較好，所以富積在高密度脂蛋白膽的周?chē)?，從而易于捕獲被表面活性劑釋放出來(lái)的高密度脂蛋白膽固醇酯，然后聚乙二醇化的膽固醇酯酶進(jìn)一步地選擇性地與高密度脂蛋白膽固醇酯作用。Sugiuchi等5 的研究結(jié)果沒(méi)有

26、涉及表面活性劑的作用，使人們?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)HDL反應(yīng)的選擇性可完全由修飾酶提供的錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)。    綜上所述，目前修飾酶、解離劑與脂蛋白之間的作用機(jī)制尚不清楚，我們認(rèn)為仍需做進(jìn)一步的基礎(chǔ)理論研究。膽固醇酯酶經(jīng)各種聚乙二醇修飾劑修飾后表現(xiàn)出了一些性能上的變化。雙臂的聚乙二醇修飾劑在保持酶活性，增加酶對(duì)HDL的反應(yīng)選擇性及提高酶的熱穩(wěn)定性等方面均優(yōu)于其他結(jié)構(gòu)的聚乙二醇修飾劑，因此應(yīng)該深入地開(kāi)展這方面的應(yīng)用研究。 【參考文獻(xiàn)】  1鄢盛愷.高、低密度脂蛋白膽固醇的勻相測(cè)定法及技術(shù)要求J.臨床檢驗(yàn)雜志，2002,20 (6):325328.2LAW M R,WALD N J,THOMPSON S G,et al.By how much and how quickly does reduction in serum cholesterol concentration lower risk of ischaemic heart disease?J.Br Med J，1994,308:367372. 3WILSON P W,ABBOTT R D,CASTEL