從酵母細(xì)胞中分離純化醇脫氫酶

1、從酵母細(xì)胞中分離純化醇脫氫酶 柳暢先，吳士筠，胡衛(wèi)釗(中南民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，武漢，430074) 摘要：本文報(bào)道了從酵母細(xì)胞中提取醇脫氫酶，并進(jìn)一步純化的過(guò)程。采用硫酸銨分級(jí)沉淀，SephadexG-100葡聚糖凝膠層析，DEAE-cellulose離子交換層析技術(shù)。收得率為2.5%，純化倍數(shù)為26.2。關(guān)鍵詞 ：醇脫氫酶；分離純化；酵母菌 中圖分類號(hào)：658 醇脫氫酶(ADH)除了在食品等工業(yè)中的作用之外，其在科學(xué)研究和分析測(cè)定中也具有重要價(jià)值，是酶法測(cè)定乙醇或乙醛含量的工具酶。沉淀法和層析法至今仍是廣泛采用的分離蛋白質(zhì)和酶的重要手段1。國(guó)內(nèi)外在這方面的研究從20世紀(jì)70年代以來(lái)有

2、很大進(jìn)展，各種類型的層析技術(shù)用于生物大分子的分離，并得到迅速發(fā)展。用離子交換層析、親和層析等方法分離純化ADH和其它蛋白質(zhì)25，經(jīng)過(guò)45個(gè)純化步驟后，純化倍數(shù)可達(dá)100多倍。我國(guó)在酶的分離純化技術(shù)上，酶制品的活性程度上，與國(guó)際先進(jìn)水平相比還有較大的差距。所以對(duì)于酶分離純化技術(shù)的研究，具有重要的意義。我們從酵母細(xì)胞中分離出醇脫氫酶，并通過(guò)硫酸銨分段鹽析、凝膠層析以及離子交換層析對(duì)該酶進(jìn)行純化，用較少的步驟得到了相對(duì)高的純化倍數(shù)。 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 儀器、試劑、菌種及培養(yǎng)基 HYA型恒溫?fù)u床；LRH-250-G型光照培養(yǎng)箱；GL-20B型高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠）；78-1型磁力加

3、熱攪拌器（杭州儀表電機(jī)廠）。硫酸銨；Sephadex G-100（Promega公司）；DEAE-cellulose；牛血清白蛋白BSA（上海伯奧生物科技公司）；三羥甲基氨基甲烷Tris（北京化學(xué)試劑公司）；氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD（武漢中健科技發(fā)展有限公司）。 酵母菌；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基；瓊脂斜面培養(yǎng)基。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 菌體培養(yǎng) 將酵母菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)24h后，再將菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床37培養(yǎng)10h。離心收集菌體細(xì)胞，貯存于-20備用。1.2.2 粗抽提液的制備取以上菌體細(xì)胞，加入磷酸氫二鈉溶液，37左右攪拌2h，再在室溫下繼續(xù)攪拌3h，

4、3000r/min離心15min，保留上清液。1.2.3 酶的純化將粗抽提液迅速加熱到55，并不斷攪拌，維持15min，然后迅速冷卻至0，4000r/min離心5min，保留上清液。用飽和度分別為10%，20%，30%，40%，45%，50%，55%，60%，65%的硫酸銨分段鹽析沉淀上清液，離心收集沉淀物，用Tris-HCl緩沖液溶解。 取45%60%飽和度的鹽析沉淀，溶于50mmol/L Tris-HCl(pH8.6)緩沖液中，上Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析柱，用相同緩沖液洗脫。收集洗脫出的具有活性的酶液，上DEAE-cellulose離子交換層析柱，用濃度為0.10.4mo

5、l/L的NaCl梯形梯度溶液洗脫。1.2.4 酶活力的測(cè)定于石英比色皿中加入3mL0.05mol/L Tris-HCl緩沖液，40L 0.05mol/L NAD溶液，40L 17mol/L C2H5OH溶液后混勻，再加入一定量的酶液，快速混勻后立即在340nm處測(cè)定吸光度變化值，計(jì)算酶活力。以每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。1.2.5 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用Folin-酚試劑法6，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 結(jié)果與討論2.1 酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞破碎 將斜面培養(yǎng)基上的菌種接種于液體培養(yǎng)基中，在36振搖培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取2mL培養(yǎng)液，在550nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸

6、光度，繪制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)8h后，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期。在離心收集的酵母細(xì)胞中加入磷酸氫二鈉溶液，37左右連續(xù)攪拌提取，每隔一段時(shí)間測(cè)定提取液在280nm波長(zhǎng)處的吸光度，繪制蛋白質(zhì)溶出曲線。經(jīng)過(guò)約2h后，酵母細(xì)胞基本破碎。見(jiàn)圖1。2.2 硫酸銨鹽析以不同飽和度的硫酸銨分段鹽析沉淀經(jīng)熱處理步驟后的酶液，測(cè)定鹽析上清液及沉淀的蛋白質(zhì)濃度及酶活性。由圖2可知，最佳鹽析范圍為45%60%硫酸銨飽和度。2.3 Sephadex G-100凝膠層析將硫酸銨鹽析后所得的酶液上Sephadex G-100凝膠層析柱，用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫曲線見(jiàn)圖3?；盍Ψ逶?420管之間。

7、凝膠層析同時(shí)起到了脫鹽和提純的作用。2.4 DEAE-cellulose離子交換層析收集由凝膠層析柱洗脫出的具有活性的酶液，上DEAE-cellulose離子交換層析柱，用濃度為0.10.4mol/L的NaCl梯形梯度溶液洗脫?；盍Ψ逶?055管之間。洗脫曲線見(jiàn)圖4。 圖1 酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 圖2 硫酸銨鹽析曲線 及蛋白質(zhì)溶出曲線1.酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；2.蛋白質(zhì)溶出曲線 1.A280；2.酶活力 Fig.1 Growth curve of yeast cell Fig.2 Ammonium sulfate salting out and resolving out curve of prote

8、in curve for ADH 1.growth curve of yeast cell； 1.A280； 2.resolving out curve of protein 2.activity of enzyme 圖3 Sephadex G-100凝膠柱層析 圖4 DEAE-cellulose離子交換層析 洗脫曲線 洗脫曲線1.A280；2.酶活力 1.A280；2.酶活力 Fig.3 Elution curve of ADH from Fig.4 Elution curve of ADH from sephadex G-100 column chromatography DEAE-cel

9、lulose column chromatography 1.A280；2.activity of enzyme 1.A280；2.activity of enzyme2.5 酶的分離純化結(jié)果醇脫氫酶經(jīng)菌體培養(yǎng)、細(xì)胞破碎及抽提、硫酸銨鹽析、凝膠層析、離子交換層析分離純化，結(jié)果見(jiàn)表1。 表1 酵母細(xì)胞中ADH的分離純化結(jié)果 Table 1 Purification results of alcohol dehydrogenase from yeast cell 純化步驟總蛋白量( mg )總活力(U)比活力(U/mg蛋白)純化倍數(shù)收得率(%)粗抽提液 硫酸銨鹽析凝膠層析離子交換層析 4375 5

10、10 154 4.2 9598 6663 3328 242.22.2 13.1 21.6 57.7 1 6.0 9.8 26.2100 69.4 34.7 2.5參考文獻(xiàn)： 1 嚴(yán)?？?生化分離工程.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.236-309.2 Roy S K, Nishikawa A H.Biotechnology and Bioengineering,1979,21:775-785.3 Chase H A,Draeger N M.Separation Science and Technology,1992,27(14):2021-2039.4 Willoughby N A,Kirsc

11、hner T,Smith M P,et al.J.Chromatogr.A,1999,840:195-204.5 Hu S,Zhang Z,Cook L M,et al. J.Chromatogr.A,2000,894:291-296.6 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)(第二版).北京：高等教育出版社，1997，137-138. Separation and purification of alcohol dehydrogenase from yeast cell Liu Chang-xian,Wu Shi-jun,HU Wei-zhao (College of Chemistry

12、 and Life Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan,430074)Abstract In this paper the procedure for the separation and purification of alcohol dehydrogenase from yeast cell was introduced.The crude extract was treated by saturated ammonium sulfate precipitation,further purified by Sephadex G-10