空心蓮子草的高效液相色譜指紋圖譜研究

1、空心蓮子草的高效液相色譜指紋圖譜研究                  作者：范文乾，熊夢曉，李瓊婭，艾倫強，潘曉云，劉焱文  【摘要】  目的 建立空心蓮子草藥材的指紋圖譜分析方法，探討不同國家和地區(qū)空心蓮子草藥材的品質差異。方法采用反相高效液相色譜法，Alltima C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 m），流動相為乙腈-0.12磷酸水溶液系統(tǒng)，線性梯度洗脫，檢測波長3

2、45 nm，進樣量為10 l。結果建立了空心蓮子草藥材的HPLC指紋圖譜，確立了空心蓮子草藥材指紋圖譜中的17個共有峰，計算了12批空心蓮子草藥材指紋圖譜與對照圖譜的相似度。結論所建立的HPLC指紋圖譜有很好的精密度、重復性和穩(wěn)定性，能夠用于空心蓮子草藥材的質量控制。 【關鍵詞】  空心蓮子草； 高效液相色譜； 指紋圖譜Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint analysis method of Alternanthera philoxeroides.MethodsChromatographic fingerprint o

3、f Alternanthera philoxeroides was investigated by RP-HPLC and the gradient elution mode was applied to chromatographic separation. Data were analyzed by fingerprint similarity evaluation software to compare the similarity of the samples.ResultsThe HPLC fingerprint of Alternanthera philoxeroides was

4、established preliminarily. 17 characteristic peaks were selected and the similarity among 12 batches of Alternanthera philoxeroides from different aera have been determined.ConclusionHPLC fingerprint method is repeatable and can be used for the quality control of Alternanthera philoxeroides.Key word

5、s：Alternanthera philoxeroides;  HPLC;  Fingerprint    空心蓮子草Alternanthera philoxeroides （Mart.） Griseb.為莧科（Amaramthaceae）蓮子草屬多年生宿根草本。論文論文參考網(wǎng)原產于南美洲，20世紀初期引種于我國，后逸為野生，現(xiàn)廣泛分布于我國北緯44°以南、東經(jīng)97°以東的海拔低且氣候相對較暖濕的廣大地區(qū)。空心蓮子草藥用全草，被廣泛應用于民間。據(jù)中藥志（第2版）記載：“空心蓮子草性苦味寒，具有清熱、涼血、解毒的功效，用于流感

6、、麻疹、乙型腦炎、流行性出血熱、疔瘡、濕疹、毒蛇咬傷等?！眹鴥葘招纳徸硬莸难芯抗ぷ鲃倓傞_展，目前已知空心蓮子草中主要含有甾體類、三萜類、黃酮類和蒽醌類等多種成分。本實驗采用反相高效液相色譜法建立空心蓮子草藥材的指紋圖譜分析方法，測定了國內10批藥材的指紋圖譜，并與美洲引種國內栽培的兩個樣品進行了比較。1  儀器與試藥1.1  儀器Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（G1322A脫氣機，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱， G1314A紫外檢測器）Agilent液相色譜工作站；METTLER TOLEDO AL204萬分之一分析天平，KQ-250B型超

7、聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-S型水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）。1.2  試藥乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司）、95乙醇（上海振興化工一廠）、乙醚（國藥集團化學試劑有限公司）、醋酸乙酯（天津市化學試劑三廠）、甲醇（上海振興化工一廠）均為分析純，水為二次蒸餾水。論文參考網(wǎng)1.3  藥材來源實驗用藥材共計12批，其中10批來源于國內，由我室人員于2005年夏秋兩季采自南方各省，取其地上部分，經(jīng)湖北中醫(yī)學院中藥鑒定學教研室吳和珍副教授鑒定為莧科蓮子草屬植物空心蓮子草的干燥全草；另有兩批樣品分別由阿根廷和美國引種，栽培于上海，由復旦大學生物多樣性科學研究所潘曉

8、云博士提供。所有藥材的來源和采集日期見表1。表1  藥材來源和采集日期（略）2方法與結果2.1  色譜條件Alltima C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 m），柱溫25，檢測波長345 nm，進樣量為10 l，流動相為乙腈（A）-0.12磷酸水溶液（B）二元洗脫系統(tǒng)，線性梯度洗脫（以A的百分體積記）：040 min，2020；4045 min，2024；4555 min，2424；5565 min，2430；65100 min，30100，體積流量為1.0 ml/min。2.2  供試品溶液制備取藥材粉末約4 g，精密稱定重量，置于錐形

9、瓶中；精密量取70乙醇50 ml，輕輕振蕩，超聲處理20 min，靜置30 min后，以70乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置后過濾，取續(xù)濾液25 ml置于蒸發(fā)皿中；水浴加熱揮去乙醇，用適量蒸餾水溶解，先以乙醚萃取3次（50，40，40 ml），棄去乙醚液，水液再用醋酸乙酯萃取3次（50，40，40 ml），棄去水液，水浴上揮干醋酸乙酯，殘渣用甲醇溶解，定容至2 ml；0.2 m微孔濾膜濾過，備用。2.3  指紋圖譜測定按照上述色譜條件，對10批空心蓮子草樣品進行測試，截取560 min的紫外光譜圖，對各個峰進行對比分析，確定17個共有峰，記錄各共有峰的保留時間和峰面積。其中第11號峰為

10、主要峰，選擇此峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各樣品的共有峰相對保留時間（見表2）能夠很好地反映空心蓮子草藥材的指紋特征，能夠作為品種鑒別的依據(jù)；在所有的共有峰當中，只有8，11，13，16號峰的峰面積接近或大于總峰面積的10，具有指紋意義，故只考慮8，11，13，16號峰的峰面積，各峰面積的相對百分含量見表3。表2  共有峰的相對保留時間（略）表3  空心蓮子草指紋圖譜主要指紋峰面積的相對百分含量（略）2.4  方法學考察及相似度計算2.4.1  精密度實驗取空心蓮子草樣品S-4供試品溶液連續(xù)進樣5次，記錄指紋圖譜。以第1

11、1號峰為參照峰， 17個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.1791.617和0.6293.900之間，均小于5，符合指紋圖譜要求。2.4.2  重復性實驗取空心蓮子草樣品S-4藥材粉末5份，分別制備供試品溶液，注入液相色譜儀并記錄指紋圖譜。結果顯示，以第11號峰為參照峰，17個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.4572.931和1.1694.888之間，均小于5，符合指紋圖譜的要求。2.4.3  穩(wěn)定性實驗取空心蓮子草樣品S-4供試品溶液分別于制備后0，3，6，9，12 h進樣分析，記錄色譜圖，以第11號峰為參照峰， 17個共有峰相對保留

12、時間和相對峰面積的RSD值分別在0.1791.617和0.6293.900之間，表明供試品溶液在12 h內基本穩(wěn)定。2.4.4  參照圖譜生成及相似度計算采用國家藥典委員會主持開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A），生成參照圖譜（中位數(shù)），如圖1。計算各供試品的指紋圖譜與參照圖譜的相似度，結果見表4。表4  各供試品指紋圖譜與參照圖譜的相似度（略）3  討論    實驗過程中選擇了254，283，330，345，360，400 nm等多個波長進行分析，發(fā)現(xiàn)檢測波長為345 nm時，色譜峰的峰強度普遍比較強，基線也比較平穩(wěn)，

13、而且空心蓮子草的多數(shù)成分在此波長下均有吸收，所以選擇345 nm作為指紋圖譜的檢測波長。流動相條件優(yōu)化過程中共計比較了6種流動相：乙腈-水、乙腈-0.12磷酸水、乙腈-0.12醋酸水、甲醇-水、甲醇-0.12磷酸水、甲醇-0.12醋酸水，并嘗試了這6種流動相的多種梯度洗脫方式，結果表明乙腈-0.12磷酸水系統(tǒng)效果最佳，采用該系統(tǒng)各個色譜峰的峰形和分離度均較好，因此選定該系統(tǒng)作為空心蓮子草藥材指紋圖譜檢測的流動相。    比較國內不同地區(qū)空心蓮子草藥材的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)藥材樣品共有峰總面積和總峰面積均有較大差異，但各樣品共有峰總面積占總峰面積的比值均大于85。而第8，11，13和16號峰的峰面積的相對含量相對穩(wěn)定，能夠作為品種鑒別的依據(jù)。    比較國內10批藥材和美洲產兩批藥材的相似度發(fā)現(xiàn)，