四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)與生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)研究

1、 科研訓(xùn)練論文(文獻(xiàn)綜述)（題 目：四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及生產(chǎn)工藝研究學(xué)生某：學(xué) 號(hào)：學(xué) 院：化工學(xué)院班 級(jí)：班2016年 1月四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及工藝研究 ： 指導(dǎo)教師：工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，呼和浩特，010051 摘要：四環(huán)素(Tetracycline),是一種對(duì)抗立克次體、多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌等病原體的“廣譜”抗生素，另外，四環(huán)素也是一種重要的飼料添加剤，擁有廣闊的市場(chǎng)前。四環(huán)素的工業(yè)生產(chǎn)通常采用發(fā)酵法，該方法以金色鏈霉菌為發(fā)酵菌株，從而生產(chǎn)合成四環(huán)素。隨著工業(yè)的快速發(fā)展傳統(tǒng)方法合成四環(huán)素已經(jīng)不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)，而本文通過(guò)控制發(fā)酵中的發(fā)酵參數(shù)，從而讓其發(fā)酵過(guò)程朝著產(chǎn)率高的方向進(jìn)行。同時(shí)

2、也提供了向培養(yǎng)基中加溴化鈉水溶液和四環(huán)素通氨補(bǔ)料方法的發(fā)酵工藝。關(guān)鍵詞：四環(huán)素；金色鏈霉菌；發(fā)酵參數(shù)；發(fā)酵工藝引言 在發(fā)酵工藝過(guò)程中攪拌速度、通氣量、發(fā)酵液的粘度、溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵罐的壓力、攪拌速度等因素，都會(huì)不同程度的影響四環(huán)素的產(chǎn)率，因此在生產(chǎn)工藝過(guò)程中對(duì)發(fā)酵參數(shù)的控制，將會(huì)朝著產(chǎn)率高的方向進(jìn)行。不同的發(fā)酵工藝方法也會(huì)有不同的產(chǎn)率，好的發(fā)酵方法不僅生產(chǎn)工藝途徑短，還能經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。一、發(fā)酵參數(shù)利用發(fā)酵法生產(chǎn)合成四環(huán)素主要控制參數(shù)一般分為物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)、生物參數(shù)三類。（一）物理參數(shù)1、溫度：微生物發(fā)酵所用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細(xì)菌。它們的最適生長(zhǎng)溫度一般在2040

3、。在發(fā)酵過(guò)程中，需要維持適當(dāng)?shù)臏囟龋拍苁咕w生長(zhǎng)和代產(chǎn)物的合成順利進(jìn)行.如四環(huán)素生產(chǎn)菌在30時(shí)合成金霉素，35時(shí)，只產(chǎn)生四環(huán)素，合成方向會(huì)改變,利用自動(dòng)控制或手動(dòng)調(diào)整的閥門，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇行管中，通過(guò)熱交換來(lái)降溫，保持恒溫發(fā)酵1。2、壓力：發(fā)酵罐壓一般為 0.02-0.05Mpa2 3、攪拌轉(zhuǎn)速:隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，發(fā)酵液粘度也隨之不斷上升，從而導(dǎo)致傳質(zhì)系數(shù)KLa下降，進(jìn)而導(dǎo)致溶氧量下降，而溶氧量的過(guò)度降低會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代產(chǎn)生不利影響。為避免上述情況，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加溴化鈉水溶液，配合一定的攪拌速度，能夠減少由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低

4、發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進(jìn)而有利于菌株的發(fā)酵。攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/Min為宜3。4、通氣量：加大通氣流量不僅會(huì)増加發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，還會(huì)帶走一些揮發(fā)性的代中產(chǎn)物，從而導(dǎo)致能耗增加、產(chǎn)率降低。適宜的通氣量尤為重要，本發(fā)明的工藝參數(shù)通氣比為1:0.525。5、濁度：反映單細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的參數(shù)。如大腸桿菌，用光密度650nm上檢測(cè)或計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。6、料液流量（L/min）:這是控制流體進(jìn)料的參數(shù)。（二）化學(xué)參數(shù)1、PH ：四環(huán)素為兩性化合物，等電點(diǎn)為PH5.4,此時(shí)以游離形式存在，PH4-7.2圍難溶于水，低于pH4的酸或高于PH8的堿性溶液中，溶解度很高。首先考慮

5、和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過(guò)程中的pH值變化在合適的圍,而四環(huán)素合成適宜PH為5.8-6.02。2、溶解氧濃度 隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，導(dǎo)致溶氧量下降，而溶氧量的過(guò)度降低會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代產(chǎn)生不利影響，而向發(fā)酵液加入溴化鈉水溶液，提高培養(yǎng)基的流變特性和溶氧水平10。3、溶解CO2濃度 四環(huán)素生物合成的適宜CO2濃度為2%-8%，濃度超過(guò)15%將抑制菌體生長(zhǎng)2。（三）生物參數(shù)1、菌絲形態(tài)：觀察菌絲形態(tài)是生產(chǎn)中最常用的方法。每隔8小時(shí)鏡檢，能及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常染菌。四環(huán)素生產(chǎn)，生產(chǎn)菌生長(zhǎng)分為I.孢子發(fā)芽，II.次生菌絲增殖，III.產(chǎn)物分泌，出現(xiàn)空胞，I

6、V.菌絲自溶，菌絲形態(tài)模糊4。2、菌體濃度：對(duì)初級(jí)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，菌濃愈大，產(chǎn)量愈高，但菌濃符合生長(zhǎng)曲線。次級(jí)產(chǎn)品如菌濃過(guò)大，由于代產(chǎn)物的積累，會(huì)影響產(chǎn)量。因其產(chǎn)品與原料并非對(duì)應(yīng)（或底物抑制，分介產(chǎn)物抑制等）7。2、 四環(huán)素的發(fā)酵工藝研究四環(huán)素的工業(yè)生產(chǎn)通常采用發(fā)酵法，該方法以金色鏈霉菌為發(fā)酵菌株。發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的溶氧量對(duì)金色鏈霉菌菌株的生長(zhǎng)代有很大的影響。而該溶氧量與發(fā)酵液的傳質(zhì)系數(shù)(KLa)成正比9。影響KLa的主要因素包括攪拌速度、通氣量、發(fā)酵液的粘度、發(fā)酵液的表面力、發(fā)酵液的離子強(qiáng)度等。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，發(fā)酵液粘度也隨之不斷上升，從而導(dǎo)致KLa下降，進(jìn)而導(dǎo)致溶

7、氧量下降，而溶氧量的過(guò)度降低會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代產(chǎn)生不利影響5。目前大多采用以下方法提高發(fā)酵液的KLa ；1)加大攪拌速度；2)加大通氣流量；3)添加水分。上述方法雖然在一定程度上緩解了KLa的下降趨勢(shì)，然而這些方法存在諸多不盡如人意的地方，例如加大攪拌速度會(huì)對(duì)菌株造成不同程度的損傷，這是因?yàn)榻鹕溍咕鷮?duì)剪切力十分敏感；而加大通氣流量不僅會(huì)増加發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，還會(huì)帶走一些揮發(fā)性的代中產(chǎn)物，從而導(dǎo)致能耗增加、產(chǎn)率降低；添加水分雖然能降低發(fā)酵液的粘度，但會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的滲透壓迅速降低，從而干擾菌株正常的生長(zhǎng)代。（一）向發(fā)酵培養(yǎng)基加入溴化鈉水溶液法 在發(fā)酵過(guò)程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加溴化鈉水溶液。采用這一

8、方法，通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加溴化鈉水溶液，一方面，能夠減少由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進(jìn)而有利于菌株的發(fā)酵；另一方面，添加溴化鈉水溶液，還能增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的電解質(zhì)濃度，進(jìn)步降低泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)能夠使發(fā)酵培養(yǎng)基維持適宜菌株生長(zhǎng)的滲透壓。1、生產(chǎn)菌種本課題采用四環(huán)素生產(chǎn)菌，即金色鏈霉菌，通過(guò)在培養(yǎng)基加入抑氯劑和氯的競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)，能合成高產(chǎn)量的四環(huán)素。其在固體培養(yǎng)基上分泌金黃色色素，氣生菌絲無(wú)色素。孢子在氣生菌絲上排列成鏈狀、圓形或橢圓形。初期是白色，后期變灰黑色，發(fā)酵中用亞甲藍(lán)染色，看菌絲狀態(tài)6。變化特征為第一期：原生菌絲期，孢子

9、發(fā)酵，成菌絲團(tuán)第二期：次生菌絲期，菌絲團(tuán)散開(kāi)，生成大量次生菌絲第三期：產(chǎn)物分泌期，菌絲變短，出現(xiàn)空胞第四期：菌絲自溶期，菌絲模糊，自溶降解2。2、 斜面培養(yǎng) 取金色鏈霉菌（Aareys)菌株在無(wú)菌條件下接種于預(yù)先制備好的固體斜面培養(yǎng)基上，在35°C下恒溫培養(yǎng)5天15。上述固體斜面培養(yǎng)基是按照常規(guī)方法制備的，其配方為3.2G/L麩皮，2.5G/L瓊月旨，0.16G/L磷酸銨，0.1G/L磷酸氫鉀，0.05G/L硫酸鎂3。3、種子制備 種子培養(yǎng)將斜面培養(yǎng)后的菌株在無(wú)菌條件下接種到預(yù)先制備好的種子培養(yǎng)基中，在33°C、300 R/Min的條件下培養(yǎng)22-25H，得到種子液14。上

10、述種子培養(yǎng)基是按照常規(guī)方法制備的，其配方為3.4 G/L葡萄糖，2.9 G/L黃豆餅粉，0.6 G/L玉米漿，0.5G/L硫酸銨，0.01G/L磷酸氫鉀，0.02 G/L硫酸鎂，0.15 G/L溴化鈉，0.4G/L碳酸鈣，0.6G/L酵母粉13。4、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)將種子制備步驟所得種液在無(wú)菌條件下接種到預(yù)先制備好的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，攪拌轉(zhuǎn)速200r/Min的條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程的通氣比為1:0.5212。發(fā)酵開(kāi)始后60h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加溴化鈉水溶液。所述溴化鈉水溶液,其體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%，其中溴化鈉的濃度為0. 005g/L和加入微量硫氫化芐（0.0001%

11、-0.0002%）。發(fā)酵開(kāi)始后180h，停止發(fā)酵，測(cè)定所得發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)，結(jié)果為30000U/mL。上述發(fā)酵培養(yǎng)基是按照常規(guī)方法制備的，其配方為8 G/L淀粉，2.5G/L黃豆餅粉，2g/L玉米漿，5G/L硫酸銨，0.015 G/L磷酸氫鉀，0.008G/L硫酸錳，0.15G/L溴化鈉，0.002G/L M-促進(jìn)劑，0.6 G/L碳酸鈣，0.008 G/L淀粉酶3。得出的結(jié)論是比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的效價(jià)高。5、此方法的發(fā)展前景 簡(jiǎn)便易行的方式增大發(fā)酵培養(yǎng)基的KLa值，效果良好。試驗(yàn)表明，采用所述方法，四環(huán)素的產(chǎn)率提高16%以上3。通過(guò)與傳統(tǒng)方法相比，過(guò)程與方法相差無(wú)幾，但是大大提高了四環(huán)素的產(chǎn)

12、率，發(fā)展前景廣闊。（二）四環(huán)素通氨補(bǔ)料法四環(huán)素通氨補(bǔ)料是四環(huán)素發(fā)酵工藝的一種新方法。四環(huán)素發(fā)酵原工藝的缺點(diǎn)是點(diǎn)是發(fā)酵單位低。通氨補(bǔ)料是用通氨的方法創(chuàng)造菌種生長(zhǎng)適應(yīng)的 p H 值,強(qiáng)化菌種代，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),以達(dá)到提高發(fā)酵單位的的。東北制藥總廠 、市第二制藥廠都采用了通氨補(bǔ)料工藝,取得了顯著效果。四環(huán)素產(chǎn)品的發(fā)酵單位、收率、全耗、主耗等各項(xiàng)技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo),都刷新了歷史最好水平。東北制藥總廠在學(xué)習(xí)華北藥廠先進(jìn)經(jīng) 驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合該廠在原料、設(shè)備、空氣動(dòng)力等方面的實(shí)際條件， 選 擇了通氨補(bǔ)料菌種、培養(yǎng)基配方和工藝控制條件,經(jīng)半年多的生產(chǎn)試 驗(yàn)證明,它有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1、平均發(fā)酵單位由18208)/ml提高到

13、215497/ml;2、總收率提高18.6%;3、罐批產(chǎn)量提高94公斤;4、主要原材料總耗下降6.6公斤/十億 ;5、年節(jié)約化工原料250噸,年節(jié)約價(jià)值26萬(wàn)元8。結(jié)論 通過(guò)對(duì)本課題的研究探討以及對(duì)相關(guān)文件的查找與整理，在發(fā)酵法合成四環(huán)素的工藝過(guò)程中，向發(fā)酵培養(yǎng)液加入溴化鈉水溶液，一方面，能夠減少由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進(jìn)而有利于菌株的發(fā)酵；另一方面，添加溴化鈉水溶液，還能增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的電解質(zhì)濃度，進(jìn)步降低泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)能夠使發(fā)酵培養(yǎng)基維持適宜菌株生長(zhǎng)的滲透壓。而培養(yǎng)基一和傳統(tǒng)工藝四環(huán)素效價(jià)對(duì)比中，能得出，此方法能

14、夠增大發(fā)酵培養(yǎng)基的KLa值，效果明顯提高了四環(huán)素的產(chǎn)率。 四環(huán)素通氨補(bǔ)料法，從上所述，經(jīng)濟(jì)方面經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，原材料的利用率得到提高。效益方面，產(chǎn)率提高，效率提升。參考文獻(xiàn)1邢杰, 湯長(zhǎng)林.錐形發(fā)酵罐(C.C.T)發(fā)酵溫度控制與發(fā)酵質(zhì)量的幾點(diǎn)認(rèn)識(shí).生物科技.2005，12：2-5.2 元英進(jìn).制藥工藝學(xué).化學(xué)工業(yè).20073寶榮, 吳飛, 偉.一種發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)素的方法.生物技術(shù).2012,14,33-344王清海.鏈霉菌R15作用機(jī)制及-葡萄糖苷酶的純化與特性研究.大學(xué).20065B.V.R.Bornot.al.Handbook imental Pharmaeology,1955,vol.78,13

15、7-1786增良.天然微生物酵素發(fā)酵機(jī)理、代過(guò)程及生物活性研究.應(yīng)用化學(xué)，2013,42-43.7左勇.金霉素?fù)u瓶發(fā)酵控制條件的優(yōu)化 .理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2012.8周毅，棟.四環(huán)素通氨補(bǔ)料工藝.大學(xué).2008.9Zhi-Fa Lv.Meta-analysis:Is bination of tetracycline and amoxicillin suitable for Helicobacter pylori infection .World Journal of Gastroenterology.2015.10Bing Li.Characterization of tetracycline resistant bacteria in saline activated sludge using next-generation sequencing analysis .Proceedings of the International Workshop on the Environmental Dimension of Antibiotic Resistance