儀器分析實驗

1、儀器分析試驗講義（第二版）授課人：李蓉王小剛西北大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系2004 年 6 月編制實驗一 鄰二氮雜菲分光光度法測定鐵一實驗?zāi)康? 了解752 型紫外可見分光光度計的構(gòu)造和使用方法。2掌握鄰二氮雜菲分光光度法測定鐵的方法。（ 1）吸收曲線的測繪；（ 2）標準曲線的測繪；（ 3）未知樣中鐵含量的測定；二原理圖 1-1 分光光度計光學(xué)系統(tǒng)圖1- 光源 2- 進光狹縫3 ， 6- 反射鏡4 ， 7- 透鏡 5- 棱鏡8- 出光狹縫9- 比色皿 10- 光電調(diào)節(jié)器11- 硒光電池12- 檢流計1 分光光度法及其測量的條件: 分光光度法主要利用的是物質(zhì)對光的選擇性吸收，按照郎伯比爾定律，在一定

2、的線性范圍內(nèi)（即濃度范圍內(nèi)）找出吸光度A 與物質(zhì)含量之間的定量關(guān)系。主要受顯色條件和測量吸光度條件的影響，其中顯色條件主要與顯色劑的用量、介質(zhì)的酸度、顯色溫度、顯色時間以及干擾離子的消除等有關(guān)；而測量吸光度的條件則與入射波長入、吸光度范圍以及參比溶液等有關(guān)。2 .鄰二氮雜菲-亞鐵配合物：在顯色前，首先用鹽酸羥胺把Fe3+離子還原為Fe2+離子，其反應(yīng)式如下：在pH=2-9的條件下，F(xiàn)e2+離子與鄰二氮雜菲生成極穩(wěn)定的橘紅色配合物，其反應(yīng)式如下：該配合物的lgK穩(wěn)=21.3 ,摩爾吸光系數(shù)&10= 1.1 X 1040測定時，溶液酸度控制在pH=5.0,以避免酸度過高導(dǎo)致反應(yīng)速度過慢，酸

3、度過低Fe2+離子水解，從而影響顯色；此外，若溶液中存在著可與顯色劑生成沉淀（Bi 3+、 Cd2+、 Hg2+、 Ag+、Zn2+）或有色配合物（CsT、Cu2+、Ni2+）的離子時，應(yīng)注意它們的干擾作用。三 752型紫外可見分光光度計的使用1 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20 分鐘；2 .按“方式鍵” （MODE將測試方式設(shè)置為吸光度方式；3 .按“波長設(shè)置”鍵（p,力設(shè)置想要的分析波長；4 .打開樣品室蓋，將盛有參比和被測溶液（約 2.5 cm）的比色皿分別插入 比色槽中，蓋上樣品室蓋；5 .將參比溶液推入光路中，按“ 100%T鍵調(diào)整零ABS 6將被測溶液拉入到光路中，此時顯示器上所顯示的

4、是被測樣品的吸光度值。四試劑10 Ng/mL的鐵標準溶液；10%勺鹽酸羥胺溶液；0.1%的鄰二氮雜菲溶液；1 mol/L NaAc 溶液。五實驗內(nèi)容1 .吸收曲線的測繪：準確移取 10 Ng/mL鐵標準溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入10%fc酸 羥胺溶液1 mL,搖勻，稍冷，加入1 mol/L溶液5 mL和0.1%鄰二氮雜菲溶液3 mL,以蒸儲水 稀釋至刻度，在752 型紫外可見分光光度計，用比色皿以蒸餾水為參比溶液，用不同的波長從570 nm開始到430 nm為止，每隔10或20 nm測定一次吸光度（其中從 530-490 nm每隔10 nm 測一次）。然后以波長為橫坐標，吸光度為縱

5、坐標繪制出吸收曲線，從吸收曲線上確定該測定的適宜波長。2 .標準曲線的測繪：取50 mL容量瓶6只，分別移取10 g/mL鐵標準溶液2.0、4.0、6.0、3 .0和10.0 mL于5只容量瓶中，另一容量瓶中不加鐵標準溶液。然后各加1 mL10%鹽酸羥胺，搖勻，經(jīng)2 min后，冉各加5 mL 1 mol/L NaAc溶液及3 mL 0.1%鄰二氮雜菲，以蒸儲水稀釋 至刻度，搖勻。在分光光度計上，用比色皿在最大吸收波長( 510 nm)處，測定各溶液的吸光 度。以鐵含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。3.未知液中鐵含量的測定：吸取 5 mL未知液代替標準溶液，其他步驟均同上，測定吸光度。

6、 由未知液的吸光度在標準曲線上查出 5 m/知液中的鐵含量，然后以每毫升未知液中含鐵多少 微克表示結(jié)果。六.記錄及分析結(jié)果比色皿： 光源電壓：(1)吸收曲線的測繪波長/ (nm)吸光度A570550530520510500490470430(2)標準曲線的測繪與鐵含量的測定試液編號標準溶液的量/mL總鐵含量/心g10022.02034.04046.06058.080610.0100未知液450吸光度七.課堂提問1 .鄰二氮雜菲分光光度法測定鐵的原理、反應(yīng) pH條件、用什麼控制酸度、力口 NHOH-HCl的目 的？2 .為什麼繪制吸收曲線？為什麼在最大吸收波長下測定？每改變？用參比液進行重新調(diào)零

7、？3 .為什麼繪制標準曲線？如何繪制標準曲線？是否每測一點必須用參比液進行調(diào)零？實驗二 醋酸的電位滴定（間接電位法）一.實驗?zāi)康? .掌握用酸堿電位滴定法測定醋酸的原理和方法。2 .學(xué)會用二階微商法計算終點體積（V終點）的方法。3 .學(xué)會用電位滴定法測定和計算 HACfe離常數(shù)的原理和方法。二.原理圖2-1電位滴定儀器裝置1-滴定管2-滴定池3-指使電極4-參比電極5-攪拌棒6-電磁攪拌器 7-電位計1 .二階微商法計算終點體積（V終點）：在酸堿滴定的過程中，利用酸堿中和反應(yīng)，隨著滴定劑 的不斷加入，被測物與滴定劑發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，溶液的批pH值不斷變化。由加入滴定劑的體積V和測得的pH值，可

8、繪制 為H/V-V滴定曲線。根據(jù)等當(dāng)點時，二階微商值等于零，計算 出滴定終點時所消耗的終點體積（V終點）。2 . HAC4離常數(shù)的測定：醋酸在水溶液中的離解如下HAc= H Ac-其離解常數(shù)Ka =H Ac HAc當(dāng)醋酸被NaOHf定了一半時，溶液中根據(jù)上式，此時H + = Ka或pH = pKa ；由此可知，醋酸電離常數(shù) Ka的負對數(shù)值，就 等于NaOHf定一半時所對應(yīng)的pH值。3 .PHS-2型酸度計的使用1 .在去離子水中過夜浸泡玻璃電極使電極活化；2 .安裝電極，調(diào)節(jié)零點；3 .用鄰苯二甲酸氫甲標準緩沖溶液（pH=4.0）校準儀器；4 .用蒸儲水洗凈電極；5 .將玻璃電極和甘汞電極插入

9、到待測溶液中，測量溶液的pH值。4 .儀器和試劑1 .儀器：PHS-2型酸度計一臺；玻璃電極及飽和甘汞電極各一支。2 .試劑：0.1 mol/L NaOH標準溶液，0.1 mol/L 醋酸，鄰苯二甲酸氫鉀標準緩沖溶液。五.實驗內(nèi)容1 . HACfe位滴定過程中溶液pH值的測定：準確吸取0.1 mol/L HAC溶液20 mL于150 mL燒杯 中，用蒸儲水稀釋至約100 mL加入酚酥2滴，放入電極及鐵芯攪拌棒，開動電磁攪拌器，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定，測量并記錄消耗的 NaOH容液的體積（VNao）和相對應(yīng)的溶液pH 值。上述滴定實驗做1次。2 .計算滴定終點時消耗的NaOH

10、§液的體積數(shù)（V終點）：V終點=Vi +V2 -Vl（內(nèi)插法）3 .計算HAC勺準確濃度（Ga& :其中GaoH為準確標定后的NaOH勺濃度4 .計算HAC勺pK值（2V終點時對應(yīng)的pH值）：PK a = （ph 1 + 9H J，1父：v 終點Vi j （內(nèi)插法）V 2 - v 126 .記錄及分析結(jié)果VNao/mLpHpH/ V7 .課堂提問1 .二階微商法確定滴定終點的方法原理？2 .為什麼鄰苯二甲酸氫甲溶液也可作為緩沖溶液？實驗三 水的pH測定（直接電位法）一.實驗?zāi)康? . 了解電位法測定水的pH值的原理與方法。2 .學(xué)習(xí)酸度計的使用方法。二.原理圖3-1玻璃電極測

11、定pH的工作電池示意圖1.玻璃電極與甘汞電極插入到被測溶液中組成原電池：赳拿繇嚴隔嬲學(xué)端品m紫"KCl （飽和），Hg2c12Hg但因式中K”無法測得，因此在實際工作中，用酸度計測定溶液的pH值時，首先必須用已知pH值的標準緩沖溶液來校正酸度計（即“定位”），根據(jù)上式測得測定液的相對pH值。校正時應(yīng)選用與被測溶液pH值相接近的標準緩沖溶液，以減 少在測量過程中可能由于液接電位、不對稱電位以及溫度變化等引起的誤差。嚴格地講，一支電極應(yīng)用兩種不同pH值的緩沖溶液校正，在用一種pH值的緩沖溶液定位后，測第二種 緩沖溶液的pH值時，誤差應(yīng)在0.05之內(nèi)。校正后的酸度計可直接用來測量水或其他溶

12、液的 pH值。三.221型玻璃電極的使用1 .在去離子水中過夜浸泡玻璃電極使其活化；2 .將玻璃電極和甘汞電極插入到標準緩沖溶液中溶液中，進行pH值的校正；3 .用校正后的酸度計測量水溶液的 pH值。四.儀器和試劑1 .儀器：25型酸度計或PHS-29A型酸度計一臺；221型玻璃電極及222型飽和甘汞電極各一支；100 mL燒杯4只。2 .試劑：pH=4.00的標準緩沖溶液（20 C）。標準緩沖溶液通常能穩(wěn)定兩個月，其 pH隨溫度 不同稍有差異。五.實驗內(nèi)容1 .將電極和燒杯用蒸儲水沖洗干凈，用 pH=4.00的標準緩沖溶液淌洗電極1-2次,電極用濾紙 吸干；2 .用pH=4.00的標準緩沖溶

13、液校正酸度計，標準緩沖溶液用完后，可倒回原試劑瓶，反復(fù)使 用。3 .用水樣將電極淌洗4-5次后，測量水樣，由儀器刻度表上讀取 pH值，重復(fù) 測量三次。4 .測量完畢后，將電極和燒杯沖洗干凈，妥善保管。六.記錄及分析結(jié)果測量次數(shù)測量內(nèi)行123pH個別絕對偏差相對平均偏差七.課堂提問1 .電位法測定水的pH值原理？2 .酸度計為什麼要用已知pH的標準緩沖溶液校正？3 .玻璃電極在使用前應(yīng)如何處理？為什麼？實驗四 水中微量氟的測定（離子選擇電極法）一.實驗?zāi)康? . 了解用F-離子選擇電極測定水中微量氟的原理與方法。2 , 了解總離子強度調(diào)節(jié)緩沖溶液的意義和作用。3 .掌握標準加入法測定水中微量 F

14、離子的方法。二.原理圖4-1氟離子測量裝置1 氟離子電極：氟離子電極（LaF3 單晶敏感膜電極，內(nèi)裝0.1 mo/L NaCl-NaF 內(nèi)參比溶液和Ag-AgCl內(nèi)參比電極）是一種電化學(xué)傳感器，它將溶液中F-離子的活度轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電位。當(dāng)氟電極插入溶液時，其敏感膜對 F-離子產(chǎn)生響應(yīng)，在膜和溶液間產(chǎn)生一定的膜電位：當(dāng)氟電極（指示電極）與飽和甘汞電極（參比電極）插入被測溶液中組成原電池時，電池的電動勢E與F-離子活度的關(guān)系當(dāng)加入TISAB （總離子強度調(diào)節(jié)緩沖溶液）時，由于離子活度系數(shù)丫為一定值，則電動勢E則與F離子濃度有如下的關(guān)系：2標準加入法：當(dāng)試液為離子強度比較大的金屬離子溶液，且溶液中存

15、在絡(luò)合劑，若要測定金屬離子的總濃度（包括游離的和絡(luò)合的），則應(yīng)采用標準加入法。該法是在原待測試樣（待測離子總濃度為Cx,體積為 V 中，加入少量體積（VS約為原試液體積的1/100）高濃度（Cs 約為Cx的100倍）的待測離子的標準溶液，根據(jù)加入標準溶液后試樣濃度的增加量Ac,以及標準溶液加入前后電動勢的差值 AE,推算出待測金屬離子的總濃度 Cx。該法的優(yōu)點是僅需一種 標準溶液，操作簡單快速，適用于組成比較復(fù)雜，份數(shù)較少的試樣。三 7601 型氟電極的使用1 在去離子水中過夜浸泡氟電極使其活化；2 .用去離子水洗到空白電位（E）為300 mV左右。3將氟電極和甘汞電極插入到待測溶液中，測量溶

16、液的E 值。四儀器和試劑1 儀器：7601 型氟電極；232 或 222 型甘汞電極；電磁攪拌器。2 .試劑：0.1000 mo/L氟標準溶液；TISAB （總離子強度調(diào)節(jié)緩沖溶液）。五實驗內(nèi)容標準加入法測定水中微量F-離子的濃度：1 .準確吸取50 mL F-離子試液于100 mL容量瓶中，加入10 mL TISAB溶液，用去離子水稀釋 至刻度，搖勻，吸取50 mL于燒杯中，測定Ei02 .在上述試液中準確加入0.5 mL（VS）濃度約為10-2 mol/L（C s）的氟標準溶液，混勻，繼續(xù)測定 E2。3 .在測定過巳的試液中，力口 5 mL TISAB溶液及45 mL去離子水，混勻，測定

17、E3。4 .計算水中微量F-離子的濃度（G）:六記錄及分析結(jié)果12EoEiE2E3CS1,用氟電極測定F-離子濃度的原理是什麼？2 . TIASB包含哪些組分？各組分的作用怎樣？3 .標準加入法測定水中微量F-離子的原理實驗五 苯系物的分析（定性與定量）一.實驗?zāi)康? .掌握SP-2100型氣相色譜儀的操作和苯系物的分析。2 .掌握用保留值定性的方法。3 .學(xué)習(xí)色譜校正因子的測定。4 .學(xué)習(xí)面積歸一化法計算各組分的含量。二.原理圖5-1氣相色譜分析流程圖1-載氣鋼瓶2-減壓閥3-凈化干燥器 4-針形閥5-流量計6-壓力表7-進樣器、氣化室 8-色譜柱9-檢測器10-放大器11-記錄儀1 .氣相

18、色譜定性、定量原理（面積歸一化法）：定性原理：利用物質(zhì)在氣固或氣液兩相中的分配系數(shù)差異進行分離的分析方法，稱之為氣 相色譜法；按照同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時間（tR） 一致，進行氣相色譜的定性分析。定量原理：確定各組分百分含量的方法，稱之為氣相色譜的定量。根據(jù)樣品洗脫情況，通 常的定量方法分為內(nèi)標法、外標法和面積歸一化法三種。當(dāng)混合樣中所有組分均被洗脫時，可 用面積歸一化法計算各組分的含量，其計算公式如下所示：其中fi為相對校正因子，其值大小等于某物質(zhì)的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子的比化2 .苯系物：苯系物指苯、甲苯、乙苯等混合物，在本實驗中使用有機皂土配入適量的鄰苯二 甲酸二壬酯

19、作固定液，氫氣作載氣，在適當(dāng)?shù)纳V條件下（柱溫、進樣器溫度、檢測器溫度、 熱絲溫度、橋電流、載氣流速等），能將各組分分開，其色譜圖如圖 4-2所示。圖4-2苯系物色譜圖1- 苯；2-甲苯；3-乙苯三.SP-2100型氣相色譜儀的操作1 .儀器的操作及參數(shù)的設(shè)定i .通載氣：打開H瓶總閥，輸出壓力調(diào)為0.4 MPa,調(diào)節(jié)儀器氣路箱版面的兩路載氣穩(wěn)壓 閥，以獲得TCD僉測器的流量；ii .通電：打開電源開關(guān)；iii .檢查或設(shè)定儀器的工作參數(shù)：A）設(shè)定柱箱溫度、進樣器溫度、TCD僉測器溫度；待儀器顯示“就緒后，設(shè)定熱絲溫度、放大、極性；B）操作條件;TCD檢測器柱箱溫度60 c進樣器溫度90 cT

20、CD檢測器溫度110 c熱絲溫度C橋電流130 mA放大10極性正載氣流速H:50 mL/min進樣量15iv .穩(wěn)定儀器：先調(diào)零點平衡粗調(diào)（調(diào)節(jié)氣路板面后方的多圈電位器），將輸出調(diào)在土100 mV以內(nèi)檢測器達到熱平衡后，然后再按面板上的“調(diào)零”按鍵將基線調(diào)零；2 .進樣：當(dāng)基線足夠穩(wěn)定時，即可進樣分析；i .用去離子水徹底清洗10小微量注射器;ii .用幾微開樣品溶劑潤洗注射器 2-3次；iii .用注射器從樣品容器中慢慢抽出幾微開樣品，取出注射器，將注射器的推桿仔細地推 倒1人刻度處（注意將氣泡排出）；iv .將注射器的針頭全部插入到進樣器中，迅速進樣并拔出注射器，同時按下數(shù)據(jù)處理裝 置的

21、“啟動”按鈕，開始采集并顯示譜圖；3.譜圖的采集及數(shù)據(jù)處理i .譜圖的采集：A） “文件”“工作目錄”，在彈出的對話框中選擇某一文件夾作為程序的工作目錄；B） “文件”“褥塞；C） 在“譜圖參數(shù)表”的“信號通道”里選擇譜圖信號的采集通道；D） 選擇“操作”菜單中的“譜圖采集”命令，這時文檔窗口譜圖區(qū)內(nèi)開始有譜圖走 動；E） 當(dāng)所有峰出完后，選擇“操作”菜單中的“手動終止”命令；ii .校正歸一法操作步驟：A） 檢查“定量組分表”里是否已含有校正因子。若無，則應(yīng)按計算校正因子操作步驟 計算待測組分的校正因子：a）在譜圖中用鼠標指著某一組分對應(yīng)的峰，按下鼠標右鍵在彈出的菜單中選擇“自 動填寫定量組

22、分表中套峰時間”命令。重復(fù)此步，將標樣中全部組分所對應(yīng)的峰 選進“定量組分表”；b） ”定量組分表”里填上標樣中各組分的質(zhì)量（g）;c）在“定量方法表”中選擇“計算校正因子”；d）選擇“操作”菜單中“定量計算”命令，程序隨即將計算結(jié)果填入“定量結(jié)果 表”中；e）在“定量組分表”中單擊“取校正因子”，將剛剛計算得到的但尚在“定量結(jié)果 表”中的校正因子取到“定量組分表”中；f）選擇“文件”菜單中的“存為摸板”命令將上述文檔窗口中的幾張表格保存到當(dāng) 前工作目錄下的“默認模板.tab ” ；B）待測樣品質(zhì)量百分含量的計算：a）按譜圖處理操作步驟所述采集并處理待測樣品的譜圖據(jù):b）在“定量方法表”中選擇

23、“校正歸一”；c） 選擇“操作”菜單中“定量計算”命令，程序隨即將計算結(jié)果填入“定量結(jié)果表”中；4. 儀器的關(guān)閉：i. .將TCDB導(dǎo)檢測器熱絲溫度設(shè)定為關(guān)閉；ii. 關(guān)閉儀器的總電源，并從電源插座上拔下儀器的電源電纜插頭；iii. 關(guān)閉載氣氣瓶總閥；四儀器和試劑1.儀器：SP-2100型氣相色譜儀；微量注射器；氫氣鋼瓶。2試劑：101 白色擔(dān)體 （ 60-80 目） ；固定液：有機皂土-34 + 鄰苯二甲酸二壬酯。苯、甲苯、乙苯單樣的標準樣品（分析純）；苯、甲苯、乙苯混合標準樣（分析純）。五實驗內(nèi)容1. 苯系物的定性分析：根據(jù)保留值用苯、甲苯和乙苯的單樣標準液定性混合液中的三組分；2. 苯系

24、物的定量分析：歸一化法計算各組分的含量i .校正因子的求?。簩⒁阎M分量（g）的標準混合溶液用“計算校正因子”法計算出校正因 子；ii 待測樣品百分含量的計算（“校正歸一”化法計算）六記錄及分析結(jié)果打印出實驗結(jié)果：包括保留時間、組分名稱以及質(zhì)量百分含量等數(shù)據(jù)結(jié)果的色譜圖譜。七課堂提問1保留值定性分析的原理？2 如何用面積歸一化法進行定量？實驗六 原子吸收光譜法測定自來水中鎂的含量一目的1 掌握原子吸收光譜分析法的基本原理；2了解原子吸收分光光度計的主要結(jié)構(gòu)，并學(xué)習(xí)其操作和分析方法；3學(xué)習(xí)選擇操作條件和干擾抑制劑的應(yīng)用；4了解從回收率來評價分析方案和測得結(jié)果的方法。二原理1 標準曲線法測定鎂的含

25、量：溶液中的鎂離子在火焰溫度下變成鎂原子蒸汽，光源空心陰極鎂燈輻射出波長為285.2 nm的鎂特征譜線，被鎂原子蒸汽強烈吸收，其吸收的強度與鎂原子蒸汽的濃度關(guān)系符合朗伯比爾定律，即鎂原子蒸汽濃度N 與溶液中鎂離子濃度c 成正比，當(dāng)測定條件固定時，利用A與c的關(guān)系，用已知不同濃度的鎂離子標準溶液測出不同的吸光度，繪制成標準曲線，根據(jù)測試液的吸光度值，從標準曲線求出試液中鎂的含量。2干擾抑制劑：自來水中除鎂離子外還含有其他陰離子和陽離子，這些離子鎂的測定能發(fā)生干擾，使測得結(jié)果偏低。加入鍶離子作干擾抑制劑，可以獲得正確的結(jié)果。3回收試驗：對于試樣的組成不完全清楚的或分析反應(yīng)不完全引起的系統(tǒng)誤差，可以

26、采用回收試驗進行校正。該法是向試樣中或標準試樣中加入已知含量的被測組分的純凈物質(zhì)，然后用同一方法進行測定，由測得的增加值與加入量之差，估算系統(tǒng)誤差，并對結(jié)果進行校正。三.TAS-990型原子吸收儀的操作1 開機依次打開打印機，顯示器，計算機開關(guān)，等計算機完全啟動后，打開原子吸收主機電源，打開蓋箱。2儀器初始化i .雙擊“AAwin”圖標，選擇聯(lián)機方式，點擊“確定”，初始化 3-5分鐘；ii 選擇元素?zé)艉皖A(yù)熱等（雙擊元素?zé)粑恢?，可更改燈位置上的元素符號）。點擊“下一步”，出現(xiàn)“設(shè)置元素測量參數(shù)”窗口；iii 設(shè)定光譜帶寬，燃氣流量，燃燒器高度等參數(shù)（一般工作燈電流，預(yù)熱燈電流，負高壓以及燃燒器位

27、置不用更改），點擊“下一步”，出現(xiàn)“設(shè)置波長窗口”：iv 不要更改默認的波長值，直接點擊“尋峰”，尋峰完畢，出現(xiàn)最大吸收波長對應(yīng)的吸收峰，點擊“關(guān)閉”，點擊“下一步”，點擊“完成”。3火焰吸收的光路調(diào)整點擊“儀器”下的“燃燒器參數(shù)”，輸入燃氣流量和高度（直接影響吸收值A(chǔ)的大?。?，點擊“執(zhí)行”，用白色濾紙觀察光電即燃燒頭是否在光路的正上方，若有偏離，更改相應(yīng)參數(shù)，點擊“執(zhí)行”，可以反復(fù)調(diào)節(jié)，直到燃燒頭和光路平行并位于光路正上方 （如不平行，可通過手動調(diào)節(jié)燃燒頭角度來完成），點擊“確定”。4設(shè)置樣品：點擊“樣品”圖標i 選擇校正方法（一般為標準曲線法），曲線方程（一般為一次方程），濃度單位，樣品名

28、稱和起始編號，點擊“下一步”；ii 輸入標準樣品的濃度和個數(shù)（可依照提示增加和減少標準樣品的數(shù)量），點擊“下一步”；iii 選擇需要或不需要空白校正和靈敏度校正（一般為不要），然后點擊“下一步”；iv 輸入待測樣品數(shù)量，名稱，起始編號，以及相應(yīng)的稀釋倍數(shù)等信息，點擊“完成”。5設(shè)置參數(shù)：點擊“參數(shù)”圖標，彈出測量參數(shù)窗口。i “常規(guī)”：輸入標準樣品，空白樣品，未知樣品等的測量次數(shù)（測幾次計算出平均值），選擇測量方式（手動或自動，一般為自動），輸入間隔時間和采樣延時（一般均為1 秒）；ii “顯示”：設(shè)置吸光值最小值和最大值（一般為 0-0.7 ），刷新時間（一般為300 秒）；iii “信號處

29、理”：設(shè)置計算方式（一般火焰吸收為連續(xù)或高峰），積分時間和濾波系數(shù)（積分為 1，系數(shù)為0.3 秒）；iv “質(zhì)量控制”：適用于帶自動進樣的設(shè)備；點擊“確定”，退出參數(shù)設(shè)置窗口。6測量i 依次打開空氣壓縮機的風(fēng)機開關(guān)，工作開關(guān)，調(diào)節(jié)壓力調(diào)節(jié)閥，使空氣壓力為0.2-0.25MPa打開乙烘鋼瓶主閥，調(diào)節(jié)出口壓力為0.05-0.06 MPa ,檢查水封；點擊“點火”圖標，火焰穩(wěn)定后，首先吸噴純凈水（將塑料管插入到蒸儲水中）15 min,防止燃燒頭結(jié)鹽;ii 點擊“測量”，吸噴空白液（將塑料管插入到空白液中）校零，即線平直后，吸噴標準溶液，點擊“開始”；每測一次標準溶液前，均需吸噴空白液校零，最終得到標

30、準曲線；按照相同操作方法測量未知樣；測量完后，點擊“終止”，退出測量窗口，關(guān)閉乙炔鋼瓶主閥，點擊“確定”，退出“熄火提示窗口”吸噴純水 1 分鐘；iii 點擊“視圖”下的“校正曲線”，查看曲線的相關(guān)系數(shù)，決定測量數(shù)據(jù)的可靠性，點擊“保存”或“打印”處理；7關(guān)機依次關(guān)閉AAwin軟件，原子吸收主機電源。乙烘鋼瓶主閥，空壓機工作開關(guān)，按放水閥， 排空氣壓縮機中的冷凝水，關(guān)閉風(fēng)機開關(guān)，退出計算機windows操作程序，關(guān)閉打印機，顯示器和計算機電源。蓋上儀器罩，檢查乙炔是否已經(jīng)關(guān)閉，清理實驗室。四、儀器和試劑1、儀器：TAS-990型原子吸收分光光度計，鎂元素空心陰極燈，乙烘,空氣供氣設(shè)備；容量瓶（

31、 50 mL 17 支， 100 mL 1 支）；吸量管（1 mL 1 支， 5 mL 3 支）。2、試劑：10.00 ug/mL 鎂的標準溶液；10.00 mg/mL 鍶溶液；二級純鹽酸，硝酸，去離子水，自來水樣五.實驗內(nèi)容調(diào)整波長到285.2 nm，燈電流3 mA;1、燃氣和助燃氣比例的選擇：調(diào)整空氣壓力為 0.2 MP價口流量，使霧化器處于最佳霧化狀態(tài)。再用去離子水調(diào)A=0,然后固定乙快壓力為0.05 MPa改變乙快流量，測量50 mL0.4 ug/mL 鎂標準液（含2.0 mL鍬溶液）的A值。記錄各種壓力、流量下的 A值（注意：每改變乙快 流量，都要用去離子水調(diào)節(jié) A至零。），經(jīng)若干次

32、測試后，從記錄結(jié)果選擇出穩(wěn)定性好且 A 值又較大時的乙快-空氣的壓力和流量。2、燃燒器高度的選擇：改變?nèi)細飧叨?，測定上述標準鎂溶液的A值，選擇出穩(wěn)定性好且A值又較大的燃燒器高度。3、干擾抑制劑鍬溶液加入量的選擇：移取自來水樣 5 mL,分別放入6只50 mL容量瓶中，分 別加入2 mL 1:1 HCl;六瓶中分別加入0、1、2、3、4、5 mL鍬溶液，用水稀釋至刻度， 搖勻。每次用去離子水調(diào)A為零，依次測定各瓶試樣的吸光度，由測得的穩(wěn)定性好且A值較大的結(jié)果，選擇出抑制干擾最佳的鍬溶液加入量。4、標準曲線白繪制：于6只50 mL容量瓶中，分別加入0、10、20、30、40、50 ug鎂的標準 溶

33、液，每瓶中加入選得的最佳量鍬溶液，每次用去離子水調(diào)零，依次測得各瓶溶液的 A值，以此數(shù)據(jù)繪制出標準曲線。5、自來水樣的測定：準確移取 5 mL自來水樣兩份，分別置于50 mL容量瓶中加入最佳量的鍬 溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；用去離子水調(diào)零，測出其 A值，再由標準曲線查出 水樣中鎂的含量R!6、回收率的測定：準確移取 5 mL自來水樣兩份，分別置于50 mL容量瓶中，加入已知量的鎂 標準溶液，再加最佳量的鍬溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻；用去離子水調(diào)零，測出 其A值，再由標準曲線查出鎂的含量，根據(jù)回收率公式計算出樣品的回收率。六.記錄及分析結(jié)果波長： 燈電流： 乙快-空氣壓力：乙快-空

34、氣流量： 助燃器高度： （1）鍬溶液加入量的選擇試液編號鋰溶液的量/mL吸光度1.02.03.04.05.0(2)標準曲線的測繪與鎂含量的測定試液編號鎂含量/ 11 g吸光度(3)七.1.2.3、10210320430540650未知液根據(jù)下式計算出鎂的濃度:回收率的測定試液編號加入的鎂量/心g 吸光度總的鎂含量/心g根據(jù)下式計算出鎂的回收率:課堂提問原子吸收光譜分析法的原理?連續(xù)測定幾個試樣為什麼每次都要用去離子水調(diào)零?是否可用回收率來校正測量結(jié)果？如何校正?實驗七離子交換液相色譜法分離標準蛋白混合物一.實驗?zāi)康? .掌握AKTA Purifier-900 型液相色譜儀的操作。2 .掌握離子

35、交換色譜分離蛋白的原理。3 .掌握液相色譜定性分析方法。4 .掌握液相色譜定量分析方法。二原理圖 7-1 高效液相色譜示意圖1 液相色譜定性、定量原理（面積歸一化法）：定性原理：利用物質(zhì)在液固兩相中的分配系數(shù)差異進行分離的分析方法，稱之為液相色譜法；按照同一蛋白在相同色譜條件下保留時間（tR） 一致，進行液相色譜的定性分析。定量原理：確定各組分百分含量的方法，稱之為液相色譜的定量。根據(jù)樣品洗脫情況，通常的定量方法分為內(nèi)標法、外標法和面積歸一化法三種。當(dāng)混合蛋白樣中所有組分均被洗脫時，可用面積歸一化法計算各組分的含量，其計算公式如下所示：.f 一 , 一 一 -一 , 一 -一 , 其中fi為相

36、對校正因子，其值大小等于某物質(zhì)的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子的比值：2離子交換色譜分離蛋白的原理：利用各蛋白質(zhì)與固定相間的靜電作用大小的差異性，在適當(dāng)?shù)纳V條件下（色譜柱、流動相、洗脫方式等），能將各蛋白組分分開，其色譜圖如圖6-2所示。圖 7-2 IDA- 裸柱分離標準蛋白混合物色譜圖1. BSA 2. RNase 3. Cyt-C 中雜蛋白4. Cyt-C 5. Lys色譜條件：色譜柱：IDA-柱（100 X 4.6 mm I.D.）; 流動相：A: 0.02 mol/L KH 2PO （pH 6.0）;B: 0.02 mol/L KH 2PO4 （pH 6.0） + 0.5 mo

37、l/L NaCl；梯度洗脫: 20 min B 從 0 到 100%；流速：1 mL/min ; 檢測器：UV （入=280 nm）;進樣量：15 g L;各蛋白濃度：2.0 mg/mL.三 AKTA Purifier-900 型生物色譜儀的操作1 開機：依次打開計算機、生物色譜儀主機，待色譜儀初始化完畢后，點擊“Unicorn ”圖標，輸入用戶名和密碼（均為“default ”），則 UNICORN Message、 r Method Editor 、System Control 、 Evaluation 四個窗口同時出現(xiàn)。2樣品測試操作i 手動式操作：A.色譜柱的平衡：點擊“ System

38、 Control 窗口下“ Manual”菜單，選擇“ Alarm & Mon”窗 口，設(shè)定色譜柱最大限壓和操作波長，點擊“ insert ;選擇“ Pump窗口，設(shè)定操作流 速，點擊“insert ”，再點擊“ Execute”，讓色譜柱在上述條件下平衡；待基線平直后， 在“Alarm & Morn"窗口中點擊“ Autozero UV ,進行自動校零，再在此條件下讓柱子平衡 幾個柱體積。B.樣品測試：選擇“ Flowpath”窗口，選擇“inject ”，點擊“insert ,選擇“ Pump窗口，設(shè)定洗脫方式和洗脫時間，點擊“insert ”；回到“Flowpa

39、th ”窗口，將樣品注入樣品環(huán)，選擇“inject ”， 點擊“ Execute ”，開始進行樣品的測試；當(dāng)圖譜中紅線出現(xiàn)時（表明樣品已進入系統(tǒng)），將選擇“Flowpath ”窗口中的“l(fā)oad ”，讓樣品環(huán)復(fù)位。C.系統(tǒng)清洗：選擇“ Pump窗口，設(shè)定清洗流速，依次將泵頭放入水、10%勺乙醇中清洗。ii 自動操作：A.方法編*5:在“ Method Editor ”中選擇“新建”圖標，選中“ Method Editor "，點擊 “OK ,進入梯度編寫程序，按照梯度要求編寫成序。編寫好后，在“ File ”中選擇 “save as”，將編輯好的方法保存到設(shè)定的文件夾下（一般為C：

40、'defaultMethod）。B.方法運彳T：在“ System Control 中選擇“ Run”，然后從編輯的方法文件中選擇出自己的 方法文件，點擊“ OK ,在"Result name ”對話框中，點擊“ Browse”，選中保存實驗 結(jié)果數(shù)據(jù)的文件夾，給出文件名；將待測樣品注入樣品環(huán)，點擊“Start ”，開始進行樣品的測試。C.系統(tǒng)清洗：選擇“ Pump窗口，設(shè)定清洗流速，依次將泵頭放入水、10%勺乙醇中清洗。3數(shù)據(jù)處理：在“Evaluation ”窗口中打開保存的數(shù)據(jù)文件，手動操作的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)在“C：.default中的Manual Runs（ System 1

41、）”中按時間順序查找；自動操作的數(shù)據(jù)結(jié)果應(yīng)在"C: 'default中自己設(shè)定的文件中查找。選擇“ File ”里“ Open to Compare”中的“Curves”進行圖譜的對比。4數(shù)據(jù)輸出：在“Evaluation ”窗口中打開保存的數(shù)據(jù)文件，得到色譜圖，選擇“File ”里“Export”中的“Curves”，選中圖譜的波長，點擊“ Select ”確認后，點擊 “Export" ；選擇圖譜輸出路徑以及文件名，點擊“ OK ,從"Excel”中打開該文件，即 可將色譜圖由ACSII碼轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可用“ Excel”或“Origin ”作

42、圖軟件，做 出對應(yīng)的色譜圖。5.關(guān)機：點擊 “ System Control 中的 “End'鍵，關(guān)閉 " UNICORN Message r,點擊 “System Control,選中“ Unlock”，點擊“ OK ,生物色譜儀主機系統(tǒng)退出（計算機與主機脫機），依次關(guān)閉生物色譜儀和計算機。四儀器和試劑1 .儀器：AKTA Purifier-900 型液相色譜儀；IDA-硅膠柱；微量注射器。2 .試劑：BSA RNase Cyt-C、Lys標準液（1 mg/mL ,以及標準蛋白混合液；其它試劑均為 分析純；水為二次蒸餾水。五實驗內(nèi)容1 .標準蛋白的定性分析：根據(jù)保留信用蛋白

43、單樣標準液定性混合液中的四組分;C=1 mg/mL,進樣量 10山標準蛋白混合物BSACyt-CRNaseLyst R2 .標準蛋白的定量分析：歸一化法計算各托白組分的含量i .校正因子的求?。簩⒁阎M分量（g）的標準混合溶液用“計算校正因子”法計算出校正因子；C=1 mg/mL,進樣量 10 L標準蛋白混合物BSACyt-CRNaseLysm （g）ii .待測樣品百分含量的計算（“校正歸一”化法計算）：六.記錄及分析結(jié)果打印出實驗結(jié)果：包括保留時間、組分名稱以及質(zhì)量百分含量等數(shù)據(jù)結(jié)果的色譜圖譜。七.課堂提問1 .離子交換色譜分離蛋白的機理？2 .保留值定性分析的原理？3 .如何用面積歸一化

44、法進行定量？實驗八小鼠腎臟組織蛋白的雙向電泳分離一.實驗?zāi)康? .掌握2-DE電泳儀（PROTEAN IEF Cell等點聚焦儀，PROTEAN! Xi垂直電泳槽）的操作2 .掌握2-DE分離蛋白質(zhì)組的原理。3 .掌握2-DE定性分析方法。4 .掌握2-DE定量分析方法。圖8-1 2-DE 電泳儀1. 2-DE分離原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向 SDS-PAGE基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就從兩方面 對蛋白質(zhì)進行分離，最終得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息。如圖 8-2所示：圖8-2被動式再水合低分子區(qū)小鼠腎臟組織蛋白的2-

45、D圖譜17cm pH 3-10 IPG 膠條，200X 200X 1.0mm SD照一月里（12%）, 120ug 上樣量，銀染2. 2-DE定性原理：通過蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的對比，根據(jù)同一蛋白點在凝膠上所處的位置相同 進行定性。3. 2-DE定量原理：通過蛋白質(zhì)組凝膠圖譜的對比，根據(jù)蛋白點顏色的深淺、以及蛋白點的大小進行初步定量。三、2-DE操作步驟（一）第一向等電聚焦1. 水化液的制備：i從冰箱中取-20 C冷凍保存的水化上樣緩沖液（I ）（不含DTT；不含Bio-Lyte ） 一小管（1ml/ 管），置室溫溶解。ii 在小管中加入 0.01g DTT,澳酚蘭，3.5ul （0.5%v/v）

46、 IPG buffer （pH 3-10） 振蕩混勻， 13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。iii從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，振蕩器上振蕩混合，13200rpm離心 15min除雜質(zhì)，取上清。2. 點樣、上樣i從冰箱中取-20 C冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（17cm pH 3-10）,室溫中放置10分鐘。ii沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。iii當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用銀子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護層。

47、iv將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極（標有+）對應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。v 在每根膠條上覆蓋2-3ml 礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。3. IPG聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為 20C）i 對好正、負極，蓋上蓋子，設(shè)置等電聚焦程序：S1 、 S2 、 S3 、 S4 、 S5 ；其中S1用于泡脹水化膠

48、條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦ii聚焦結(jié)束的膠條，立即進行平衡、第二向 SDS-PAG電泳，否則將膠條置于樣品水化盤-20 冰箱保存。（二）平衡1 配制膠條平衡緩沖液I 。在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ 水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml 膠條平衡緩沖液I 。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。2 配制膠條平衡緩沖液II 。第一次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液 I 。并濾紙吸取多余的平

49、衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。再加入膠條平衡緩沖液II ，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。（三）第二向SDS-PAG電泳1. 配膠、灌膠i配制10%勺丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板 夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ 水、乙醇或水飽和正丁醇封面，保持膠面平整，聚 合 30 分鐘。ii 待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ 水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ 水沖洗2. 轉(zhuǎn)移i從-20 C冰箱中取出的膠條，先于室溫放置 10分鐘，使其溶解。用濾紙吸去 SDS-PAG限內(nèi) 烯酰胺凝膠上方玻璃板間多余的液體。將

50、處理好的第二向凝膠放在桌面上，長玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂部對著自己。ii 將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。11. 將 10倍電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，制成1 倍電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。iii 第二次平衡結(jié)束后，徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II 。并用濾紙吸取多余的平衡液（將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）。將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1 倍電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其余膠條同樣操作。將放有膠條的SDS-PAGEE膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封

51、膠液。iv 用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時，要注意是推動凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。放置5 分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。3跑膠i在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓，待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流 （或電壓）（20-30mA/gel/17cm）, 待澳酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。ii電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切

52、角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。（四）銀染固定 一敏化 一洗滌 一銀染 一洗滌WT?顯影？ 找B? 洗滌？ 注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。四.儀器和試劑1 .儀器：PROTEAN IEF Cell等點聚焦儀，PROTEAN! Xi垂直電泳槽（Bio-Rad公司）；玻 璃勻漿器（陜西化玻器械有限公司）；TGL-16G-A高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀 器廠）;電熱恒溫水浴鍋（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；ULTFreezer （美國Thermo Forma公司）。2 .試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris ）,兩性離子表面活性劑（CHAPS,苯甲基磺酰氟（PMSF）,

53、 二硫蘇糖（DTT ,丙烯酰胺（Acrylamide ） , N,N -甲叉雙丙烯酰胺（N,N -Methylene bisacrylamide ）,過硫酸?。ˋPS,十二烷基磺酸鈉（SDS,四甲基乙二胺（TEMER 澳酚藍（Bromophenol Bule） , 2-琉基乙醇（2-ME），低分子量標準蛋白質(zhì)均購自華 美生物工程公司；載體兩性電解質(zhì)（CA pH=3.5-9.5 ）,購自北京經(jīng)科宏達生物技術(shù) 有限公司；礦物油（Silicon Oil ） , IPG干膠條均購自Bio-Rad公司；其他試劑均 為國產(chǎn)分析純。五.實驗內(nèi)容1 .樣品的溶解預(yù)冷生理鹽水沖洗鼠腎臟組織 3次，迅速將清洗的組

54、織分割成適宜的小塊，濾紙吸取多余 的液體，稱量50mg濕組織，放入玻璃組織勻漿器中加 1mL裂解液（裂解液I : 9.5 mol/L Urea+ 40mmol/L Tris+ 4%w/v CHAPS 裂解液 口 ： 9.8 mol/L Urea+ 40mmol/L Tris+4%w/v CHAPS+1mmol/L PMSF+1mmol/L EDTA+65mmol/L DTT+ 0.5%v/v IPG buffer ,冰浴中勻漿，冰 上靜置10-15min, 17c下，15000rpm離心10min；取上清，用LOWORY定量5 ,蛋白濃度約為 20 mg/mL ,分裝于小離心管中，-78 C下

55、凍存?zhèn)溆?；取一定量上述樣品液，加再水合液?mol/L Urea+2%w/v CHAPS +微量澳芬蘭）稀釋至終體積 300仙L,混勻后室溫下靜置1hr, 離心后即為含樣品的再水合液。2 .凝膠電泳移取含有適量蛋白濃度的泡脹液 300uL,采用被動式和主動式（加 50V低壓）的膠內(nèi)樣品 再水合法泡脹17cm的IPG膠條16 hr。按照IEF程序20c下恒溫等電聚焦：0150V40min（線 性）；150500V 40min （線性）;5001000V1hr （線性）；5001000V1hr （線性）；1000 2000V1hr （線性）；20003000V1hr （線性）；30004000V 1hr （線性）；40006000V 1hr （線性）；60008000V 1hr （線性）8000V 4hr （快速）。聚焦后IPG膠條在6mL平衡緩沖液中（ 1.5 mol/L Tris-HCl（pH=8.8）+ 6 molL Urea + 2%（w/v） SDS+30%（