植物轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生機制

1、植物轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生機制翟敏1,魏華麗2(1.信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校,河南信陽464000;2.中國林科院林業(yè)研究所,北京100091摘要:隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用,轉(zhuǎn)入目的基因在越來越多的植物上發(fā)生不表達(dá)或表達(dá)不完全等沉默現(xiàn)象。從基因沉默現(xiàn)象的定義入手,通過論述基因沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),在染色體DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平三種不同層次上探討了轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象發(fā)生的原因。認(rèn)為轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象是三個層次相互作用的結(jié)果,且和環(huán)境等外部因素有關(guān),在核酸水平上均是DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA相互作用的結(jié)果。關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因沉默;植物;轉(zhuǎn)錄沉默;轉(zhuǎn)錄后沉默通過基因工程方法對生物的遺傳物質(zhì)DNA

2、 進(jìn)行直接體外操作,通過質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化等手段導(dǎo)入外源DNA,使遺傳物質(zhì)發(fā)生定向改變,從而使短期內(nèi)改變生物的某些遺傳特征成為可能。迄今為止,已轉(zhuǎn)化了六十多種不同的植物,部分轉(zhuǎn)基。然而,隨著研究的深入,植物轉(zhuǎn)入目的基因的沉默、不穩(wěn)定表達(dá)或不完全表達(dá),已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究和應(yīng)用的主要障礙。轉(zhuǎn)基因沉默也己成轉(zhuǎn)基因作物商品化和一些優(yōu)良遺傳改良的主要障礙1。從80年代初美國科學(xué)家獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物起,植物基因工程發(fā)展迅猛,許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化相繼獲得了成功,并再生出可育的轉(zhuǎn)基因植株,有些已投入到商品化生產(chǎn)上。但是將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞,僅僅是遺傳轉(zhuǎn)化的第一步,緊接著還需要外源DNA的穩(wěn)定整合和有效表達(dá)

3、,才能培育出具有新遺傳性狀的轉(zhuǎn)基因植物。而在高等植物中,大約30%的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灦及l(fā)現(xiàn)了基因沉默2。1什么是植物轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象轉(zhuǎn)基因沉默(Transgene silencing,又稱轉(zhuǎn)基因失活,即當(dāng)向生物體內(nèi)導(dǎo)入外源基因時,引起相應(yīng)序列的內(nèi)源基因的表達(dá)被特異性抑制的一種基因調(diào)控現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)基因與同源的內(nèi)源基因之間,不影響其他基因的表達(dá),轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因經(jīng)重組發(fā)生分離或減數(shù)分裂分離后,沉默的轉(zhuǎn)基因表達(dá)得以恢復(fù)3。造成轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性受抑制的主要原因是在轉(zhuǎn)基因之間或者是在轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源的同源基因之間存在著序列同源性。因此,轉(zhuǎn)基因沉默通常又叫做由同源性決定的基因沉默(homology-de2

4、pendent gene silencing2或重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默(Repeat-induced gene silencing4。2植物轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1990年,Jorgenson等人試圖將查爾酮合成酶基因轉(zhuǎn)入紫色矮牽?；ㄖ幸约由钏念伾?結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些花顏色不但沒有加深反而表現(xiàn)出雜色,有的甚至成為純白色。后來發(fā)現(xiàn)這是因為轉(zhuǎn)入的查爾酮合成酶的基因和牽?；ㄖ姓５幕蛞黄鸢l(fā)生了沉默,因此他把這種現(xiàn)象叫做共抑制(co-supp ression,表現(xiàn)為一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-t ranscriptional gene silencing, P T GS,這是一種轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的基因沉默

5、(t rans2 gene-induced gene silencing,TIGS,而隨后研究發(fā)現(xiàn)病毒侵染植物后同樣會誘導(dǎo)產(chǎn)生P T GS,這種現(xiàn)象被稱為病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-in2 duced gene silencing,V IGS5。1995年,Su Guo和Kemp hues在用反義抑制的方法使果蠅(Drosop hila中的pal-I基因失活的實驗中意外發(fā)現(xiàn)用有義鏈也能使基因失活,此實驗第一次證明了雙鏈RNA(double-st rand RNA能導(dǎo)致基因沉默5。1998年,Fire等在秀麗新小桿線蟲(Cae2 norhabditis elegans中發(fā)現(xiàn)用dsRNA比用單

6、鏈反義RNA使基因失活的效果更好,并且將線蟲中RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象稱為RNA干涉(RNA interference,RNAi6。Timmons等和Fire等通過實驗還發(fā)現(xiàn)將反義RNA和正義1112010(1陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)3收稿日期:2009210218作者簡介:翟敏(19792,女,河南商丘人,碩士,從事樹木學(xué)及植物配置與造景的教學(xué)與研究。RNA同時注射到秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans比單獨注射反義RNA誘導(dǎo)基因沉默的效率高10倍,并推斷dsRNA觸發(fā)了高效的基因沉默機制,極大降低了靶mRNA水平5。2000年,Macino等人向粗糙脈胞菌(Neu2 ro spo

7、ra crassa中導(dǎo)入額外拷貝的類胡蘿卜素基因時也發(fā)現(xiàn)了相似的基因沉默現(xiàn)象,后將此現(xiàn)象稱為抑制(quelling。隨著以后幾年中研究者已在擬南芥、煙草、番茄、馬鈴薯、水螅、渦蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等各種生物體內(nèi)對這種RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象進(jìn)行深入的研究,并已逐漸了解其中的作用機理。在不同物種中發(fā)現(xiàn)的這些轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象,盡管在細(xì)節(jié)上不盡相同,但都涉及dsRNA的參與,表現(xiàn)為一種RNA介導(dǎo)的基因沉默,它們在作用機理上有相似之處6。在實驗研究中也發(fā)現(xiàn),有時通過Sout hern印記、R T-PCR 等證實轉(zhuǎn)基因已整合到宿主的基因組中,且保留完整的拷貝,但是轉(zhuǎn)基因不能穩(wěn)定表達(dá)或表達(dá)水平低下,有時甚

8、至完全不表達(dá)7。3植物轉(zhuǎn)基因沉默的發(fā)生機理近幾年來研究表明,引起基因沉默的原因很多,轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)和構(gòu)型、在植物上的整合位點、轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平等都與沉默有關(guān),外界環(huán)境如過高的溫度、過強的光照也會增加基因沉默發(fā)生的幾率和產(chǎn)生時間,此外,外源基因的表達(dá)還受植物發(fā)育因子(如親本年齡的影響.因此,植物轉(zhuǎn)基因沉默的作用機制可能不是單一的,而是各種機制共同作用的結(jié)果,是植物本身的防御系統(tǒng)和外界環(huán)境因素協(xié)同作用的產(chǎn)物.轉(zhuǎn)基因沉默可以發(fā)生在染色體DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平三種不同的層次上8。3.1染色體DNA水平的轉(zhuǎn)基因沉默發(fā)生在染色體DNA水平的轉(zhuǎn)基因沉默叫做位置效應(yīng)(po sitio n effec

9、t。當(dāng)導(dǎo)入的外源基因隨機地插入到宿主基因組時,如果被導(dǎo)入到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū),就有可能進(jìn)行高水平的轉(zhuǎn)錄,如果外源基因插入轉(zhuǎn)錄不活躍區(qū),則只能進(jìn)行低水平的轉(zhuǎn)錄或不能轉(zhuǎn)錄。按照染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)組織的環(huán)狀結(jié)構(gòu)模型,核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(mat rix attachment regions, MARs作為邊界元件與核基質(zhì)結(jié)合,使兩個MAR之間的基因片段被界定成一個獨立的染色質(zhì)環(huán)(1oop,并作為隔離子(insulator阻擋鄰近染色質(zhì)區(qū)的順式調(diào)控元件對環(huán)內(nèi)基因的影響,使位于染色體環(huán)內(nèi)的基因可作為一獨立的表達(dá)調(diào)控單位而存在。MAR可能使轉(zhuǎn)基因在受體基因組整合后形成獨立的環(huán)狀結(jié)構(gòu),從而提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平并減少轉(zhuǎn)基因在不同

10、株系表達(dá)差異7。3.2轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上的轉(zhuǎn)基因沉默叫做轉(zhuǎn)錄失活。反向重復(fù)的基因或轉(zhuǎn)基因可以進(jìn)行異位配對,配對的DNA作為信號,使DNA異染色質(zhì)化或從頭甲基化,這樣轉(zhuǎn)錄過程就會受到抑制。此外,DNA-RNA協(xié)同(association也是造成轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的原因之一。3.3轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默是RNA水平基因調(diào)控的結(jié)果,比轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默更普遍,共抑制(co-suppression現(xiàn)象是其研究的熱點。共抑制是指在外源基因沉默的同時,與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制。轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的特點是外源基因能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA,但正常的mRNA不能積累,也就是

11、說mRNA一經(jīng)合成就被降解或被相應(yīng)的反義RNA或蛋白質(zhì)封閉,從而失去功能。其中RNA-RNA作用又稱RNA干擾,涉及RNA的降解機制。此外,過量的RNA也可能和同源的DNA相互作用導(dǎo)致重211陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)2010(1新甲基化,使基因失活10。異位配對模型認(rèn)為:異位配對的DNA轉(zhuǎn)錄出正常RNA與異常RNA,正常RNA與異常RNA相互作用,共同降低了正常RNA的加工和翻譯。由于多拷貝的存在,引起DNA的反向連接,從正鏈轉(zhuǎn)錄的反義RNA與從負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄的RNA形成雙鏈RNA,干擾mRNA的正常加工和翻譯。減數(shù)分裂后,細(xì)胞內(nèi)mRNA水平下降, RNA-RNA相互減弱,然后轉(zhuǎn)錄因mRNA水平開始上升。一定時

12、間后,RNA-RNA作用加強,轉(zhuǎn)基因又發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默1。異常RNA模型:由K ooter等提出,認(rèn)為轉(zhuǎn)基因mRNA異常結(jié)構(gòu)或異常RNA可以激活P T GS。分子間和分子內(nèi)配對模型:Metzlag等認(rèn)為,外源基因的導(dǎo)入干擾了前體mRNA加工的正常進(jìn)行,引起mRNA的大量降解,造成內(nèi)、外源基因的沉默11。需要注意的是,上述三種機制并不是獨立的,而是相互關(guān)聯(lián)的。dsRNA介導(dǎo)的植物RNAi引發(fā)的基因沉默可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,也可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。對于部分轉(zhuǎn)基因植物來說,基因沉默可能是因為特異基因的甲基化而引起。如: Kumpatla等在將bar基因?qū)胨镜膶嶒炛?發(fā)現(xiàn)bar基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生了沉默。

13、K ohli等和Fu等在用基因槍法獲得轉(zhuǎn)基因水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,同時發(fā)現(xiàn)沉默原因是由于外源基因本身及其啟動子U bil發(fā)生甲基化引起的。此外,Fu等的研究還表明部分植物中dsRNA介導(dǎo)的基因沉默亦可在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生。馬中良等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻,結(jié)果亦表明dsRNA在轉(zhuǎn)基因水稻中能高效誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的發(fā)生5。轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默是發(fā)生在核內(nèi)的時間,而轉(zhuǎn)錄后的基因沉默是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。兩者都與甲基化有關(guān),轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默主要發(fā)生在啟動子區(qū)域,基因的轉(zhuǎn)錄受抑制;而在轉(zhuǎn)錄后的基因沉默中,甲基化主要發(fā)生在基因的編碼區(qū),基因能夠轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生mRNA,但mRNA在細(xì)胞質(zhì)中被特異性地降解,不能正常翻

14、譯成蛋白質(zhì)造成的,轉(zhuǎn)錄后基因沉默發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中,轉(zhuǎn)錄物能在細(xì)胞核中積累但在細(xì)胞質(zhì)中mRNA迅速降解或不能正常地加工。二者在時間上并非簡單的前后關(guān)系,在空間上也不因為核膜的存在而相互隔離?；虺聊瑱C制在核酸水平上均是DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA相互作用的結(jié)果,所以一般認(rèn)為對基因沉默機制的研究開啟了認(rèn)識DNA水平及RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的新紀(jì)元,并提出了基因免疫,即基因組對外源基因入侵有抵抗能力的新觀念13。參考文獻(xiàn):1鄒永梅,施季森,諸葛強,等.遺傳轉(zhuǎn)化植物中沉默基因的消除J.分子植物育種,2006,4(1:952102. 2王紅梅,張獻(xiàn)龍,蔡忠民,等.植物轉(zhuǎn)基因沉默機制及消

15、除對策J.棉花學(xué)報,2003,15(4:2482251. 3劉悅萍,趙曉萌,宮飛.轉(zhuǎn)基因植物中外源基因沉默機制的研究進(jìn)展J.中國農(nóng)學(xué)通報,2005,21(4:80283.(下轉(zhuǎn)第125頁311翟敏等:植物轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生機制量化研究18。應(yīng)全面運用上述手段,從各個方面檢測和治理農(nóng)藥的殘留,爭取盡快降低和消除農(nóng)殘對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們生活所造成的危害和威脅,這是一項長期而艱巨的造福于人類的偉大事業(yè)。參考文獻(xiàn):1熊季霞,申俊龍.淺談我國中藥如何走向世界J.中國藥管理雜志,2005,14(4:43245.2張艷.農(nóng)藥殘留分析中不同提取溶劑的評價J.甘肅農(nóng)業(yè)科技,2006,(6:28229.3葉發(fā)兵,黃

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