第五章常用生物化學檢驗技術

1、第五章 常用生物化學檢驗技術第一節(jié) 光譜分析技術教學目的：1、掌握分光光度技術的基本原理及定性和定量方法。2、熟悉分光光度計的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法。3、了解其他光譜分析技術的基本原理及在生化檢驗中的應用。教學重點：吸收光譜分析法的測定原理教學難點：發(fā)射光譜分析法和散射光譜分析法的原理及應用：教學方法和手段：課堂講授為主，多媒體教學為輔，實驗教學加強理解。授課時數(shù)：2學時教學內(nèi)容和組織：在臨床生化檢驗中，光譜分析是一類十分重要的技術，應用極為廣泛。應用吸收光譜原理進行分析的主要有可見光及紫外光分光光度法，以及原子吸收分光光度法。紅外分光光度法雖然也屬于吸收光譜法，但在臨床生化上應用不多。應用發(fā)射

2、光譜原理進行分析的主要有熒光分析法和火焰光度法。應用散射光譜原理進行分析的主要是比濁法，包括免疫比濁法等。1、分光光度技術的基本原理檢測原理：（1）吸光度與透光度：當光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設入射光強度為I0，透射光強度為I，I和I0之比稱為透光度，透光度的負對數(shù)稱為吸光度。（2）Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎。其表達式為：A = KLC（式中A為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度）2、分光光度計的基本

3、結(jié)構(gòu)：光源、單色器、比色杯、檢測器、顯示器3、操作方法（見實驗指導）4、分光光度技術的定性和定量方法；（1）標準曲線法：將一系列濃度不同的標準溶液按照一定操作過程顯色后，分別測吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。在相同條件下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標準曲線找出相對應的濃度。（2）對比法：將標準樣品與待測樣品在相同條件下顯色并測定各自的吸光度。由于測定體系溫度、厚度以及入射光波長是一致的，所以標準與待測樣品K值及L相等，可應用下式比較計算待測樣品濃度：Cx=Cs×AsAx。（3）差示法：有色溶液濃度太濃或太?。ㄍ腹舛瘸^90%-10%）時，測定結(jié)果會產(chǎn)生較大誤

4、差，此時可采用差示法（differential spectrophotometry)。高濃度樣液差示法：用標準品制備濃度稍低于試樣的參比溶液，先將儀器光門關閉，調(diào)節(jié)T%=0，再將參比溶液置于光路上，打開光門使T%=100，然后測定樣品溶液的透光率即可。例如某一樣品溶液原來的透光率讀數(shù)為5%（10%以下），用差示法后讀數(shù)為50%，這實質(zhì)是把透光率標尺擴展了10倍，從而減少了測量誤差。低濃度樣液差示法：用標準品制備濃度稍高于試樣的參比溶液，將它放在光路上，打開光門，調(diào)節(jié)透光率至0%，然后換以空白溶劑，調(diào)節(jié)刻度至100%。此后測定樣品的讀數(shù)即可。（4）多組分混合物的測定：當試樣中有兩種或兩種以上的組

5、分共存，可根據(jù)各組分的吸收光譜的重疊程度，選用不同的定量方法。如果混合物各組分的吸收峰互不干擾，這時可按單組分的測定方法，選擇測定波長，分別測定各組分的含量；若各組分的吸收峰相互重疊，可采用解聯(lián)立方程法、等吸收點法、雙波長法等解決量中的干擾問題。5、其它光譜分析技術：（1）火焰光度法基本原理和儀器組成；（2）原子吸收分光光度法的基本原理；儀器組成和特點；（3）熒光光度分析法，許多物質(zhì)都是光致發(fā)光的，即它們可以吸收電磁輻射，然后又重新發(fā)射出相同或較長波長的輻射。光致發(fā)光最常見的類型是熒光（fluorescence)和磷光（phosphorescence）。利用熒光強度進行分析的方法，稱為熒光法（

6、fluorimetry)。在熒光分析中，待測物質(zhì)分子成為激發(fā)態(tài)時所吸收的光稱為激發(fā)光，處于激發(fā)態(tài)的分子回到基態(tài)時所產(chǎn)生的熒光稱發(fā)射光。熒光法測定的是受光激發(fā)后所發(fā)射的熒光的強弱，而不是測定激發(fā)光的強弱。凡能產(chǎn)生熒光的化合的，均可采用熒光分析法進行定性或定量。熒光強度的影響因素：溶劑：增大溶劑的極性，將使-躍遷的能量降低，熒光增強。在水、乙醇、環(huán)已烷等這些常用溶劑中常含有熒光雜質(zhì)，影響測定，必須在使用前作凈化處理。熒光物質(zhì)的濃度：對于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定頻率和一定強度的放射光I。照射下，如果光被吸收的百分率不太大，且溶液的濃度很小，當溶液的厚度不變時，則它所發(fā)生的熒光強度F和該溶液的濃度

7、C成正比，即F=I。ECL式中為熒效率。當熒光物質(zhì)濃度高時，會發(fā)生分子間碰撞，使熒光效率降低。因為溫度增高后使分子間碰撞次數(shù)增加，消耗分子的內(nèi)部能量。溫度：大多數(shù)情況隨溫度升高時，熒光效率降低。因為溫度增高后使分子間碰撞次數(shù)增加，消耗分子的內(nèi)部能量。溶液的PH值：當熒光物質(zhì)本身為弱酸或弱堿時，溶液的pH值改變對溶液熒光強度產(chǎn)生影響較大，因為有些物質(zhì)在離子狀態(tài)時無熒光，而有些則相反，也有二者均有熒光，但熒光光譜有所不同。第二節(jié) 電泳技術教學目的：1、掌握電泳的概念；電泳的基本原理；影響電泳的因素2、熟悉電泳遷移率；醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳；聚丙烯酰胺凝膠電泳：等電聚焦電泳教學重點：電泳的概念

8、；醋酸纖維薄膜電泳；影響電泳的因素教學難點：電泳遷移率教學方法和手段：課堂講授，實驗教學授課時數(shù)：2學時教學內(nèi)容和組織：1、概念： 在直流電場中，帶電粒子向帶符號相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electropho-resis）。1809年俄國物理學家Pece首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分離蛋白質(zhì)的界面電泳（boundary electrophoresis）之后，電泳技術才開始應用。本世紀60-70年代，當濾紙、聚丙烯酰胺凝膠等介質(zhì)相繼引入電泳以來，電泳技術得以迅速發(fā)展。豐富多彩的電泳形式使其應用十分廣泛。電泳技術除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外，最主要用于蛋白

9、質(zhì)、核酸、酶，甚至病毒與細胞的研究。由于某些電泳法設備簡單，操作方便，具有高分辨率及選擇性特點，已成為醫(yī)學檢驗中常用的技術。電泳技術：利用帶電粒子在電場作用下定向移動的特性，對混合物組分進行分離、純化和測定的一項技術。電泳基本原理：溶液中粒子必須帶有凈電荷才能在電場中移動，粒子在溶液中的帶電狀態(tài)主要由粒子表面的化學基團和溶液的pH值決定。其中電泳遷移率是物質(zhì)的特征常數(shù)，混合物各組分的電泳遷移率不同時，即可在電場中彼此分離。等電點：當溶液中某物質(zhì)所有粒子都電離為兼性離子時，該溶液的pH值稱為該物質(zhì)的等電點。按照同離子效應，粒子在溶液中的電離狀態(tài)和荷電量可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值加以控制。影響電泳的

10、因素：（1）分子的形狀和性質(zhì)：蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，在分子量接近時，球狀分子比纖維狀分子的移動速度快，表面電荷密度高的粒子比表面電荷密度低的粒子移動速度快；（2）電場強度：電場強度增大，電泳速度加快，但是同時電流強度也增大，產(chǎn)熱增多，為使電泳得到滿意的結(jié)果，要選擇適宜的電場強度；（3）電泳緩沖液：電泳緩沖液起著決定粒子荷電性質(zhì)和荷電量的作用，同時起著導電的作用，電泳時對緩沖液的化學組成、pH值和離子強度都有一定要求；（4）支持介質(zhì)：支持介質(zhì)對電泳的影響主要表現(xiàn)為吸附作用和電滲作用；（5）蒸發(fā)：水分的蒸發(fā)導致支持介質(zhì)中緩沖液濃縮，離子強度加大，標本分電流減小，電泳速度減慢。由于支持介質(zhì)水分的

11、蒸發(fā)，使虹吸作用加強，兩邊電泳槽中緩沖液沿著支持介質(zhì)由兩端向中間對流，使標本區(qū)帶向中音集中并彎曲，導致分辨率下降。2、常用的電泳技術（1）醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因為膜的親水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5g的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。操作過程及原理見實驗指導。（2）凝膠電泳以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分