小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)實驗(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 山東大學(xué)實驗報告 2011年3月30日姓名 張行潤 系年級 2009級生科4班 學(xué)號 7 同組者 張少華科目 細(xì)胞生物學(xué)實驗 題目 小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)實驗 儀器編號 105一、 實驗?zāi)康牧私庠?xì)胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。學(xué)習(xí)細(xì)胞計數(shù)、營養(yǎng)液的配制等，初步掌握無菌操作方法。二、 實驗原理(一) 細(xì)胞原代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細(xì)胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個游離細(xì)胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱?/p>

2、術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必須的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。(二) 細(xì)胞死活鑒定 死活細(xì)胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細(xì)胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。不同的死活細(xì)胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機(jī)理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異。染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機(jī)理的不同，染料或使死細(xì)胞著色，或使活細(xì)胞著色。死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異主要包括：死活細(xì)胞細(xì)胞膜通

3、透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細(xì)胞死亡之后，細(xì)胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍(lán)鑒別細(xì)胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺盼藍(lán)，又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細(xì)胞膜。所以經(jīng)臺盼藍(lán)染色后只能使死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。甲基藍(lán)有類似的染色機(jī)理。植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。死活細(xì)胞在代謝上的差異：是采用美藍(lán)染料鑒定酵母細(xì)胞死活的依據(jù)。美藍(lán)是一種無毒染料，氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。由于活細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍(lán)染色后活的酵母細(xì)胞無色；而死細(xì)胞或

4、代謝緩慢的老細(xì)胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍(lán)處于氧化態(tài)，從而被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。除此之外，還有一些細(xì)胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細(xì)胞液泡著紅色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不被著色；死細(xì)胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍(lán)-中性紅混合染色法。三、 實驗器材剪子，棉球，75%酒精，移液槍，無菌操作臺，正置光學(xué)顯微鏡，倒置光學(xué)顯微鏡， 解剖盤，滴管，離心管，離心機(jī)，注射器，Eppendorf管，培養(yǎng)皿，酒精燈，塑料培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，血細(xì)胞計數(shù)板等。四、

5、實驗材料小鼠1只，細(xì)胞培養(yǎng)液（含生長因子），Trypen Blue染液，PBS緩沖液，五、 實驗步驟(一) 細(xì)胞的原代培養(yǎng)1. 取材：取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。2. 分離脾細(xì)胞：用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用L型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用L型針頭輕輕刮出脾細(xì)胞。在均勻吹勻脾臟細(xì)胞。吸取上述分離的單個脾細(xì)胞懸液，放入Eppendorf

6、管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。3. 培養(yǎng)脾細(xì)胞：取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標(biāo)記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，吸取200ul脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(二) 細(xì)胞死活鑒定及計數(shù)1. 試劑配制：用生理鹽水配成5%Tyrpen Blue染液，備用。2. 染色計數(shù)：取0.5mL細(xì)胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后將細(xì)胞放在血細(xì)胞

7、計數(shù)板上觀察死活情況，注意不要有氣泡產(chǎn)生，放大倍數(shù)為10x10。染色后活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞顯示藍(lán)色。注意染色時間不能超過15min，否則染液將細(xì)胞毒殺。3. 計數(shù)：在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算血細(xì)胞計數(shù)板的4個4小方格的細(xì)胞數(shù)量。包括細(xì)胞總數(shù)與死細(xì)胞數(shù)量。壓線者計上不計下，計左不計右。4. 計算細(xì)胞活力：根據(jù)公式：圖1.血細(xì)胞計數(shù)板示例圖六、 注意事項 1、嚴(yán)格進(jìn)行動物消毒，需用75%酒精消毒。2、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。3、吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液體時，避免碰撞。4、離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。5、實驗者離開超凈臺時，要隨時

8、用肘部關(guān)閉工作窗。6、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。七、 實驗結(jié)果本次試驗中計數(shù)所用材料為培養(yǎng)1-2周后的小鼠脾細(xì)胞，培養(yǎng)液呈粉紅色，且未被染菌，說明原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中小鼠脾細(xì)胞得到增殖，部分營養(yǎng)物質(zhì)和其生存所必須的物質(zhì)被消耗掉。本次試驗采取的是Tyrpen Blue染液，活細(xì)胞不會被染色而呈無色，死細(xì)胞會被其染色而呈藍(lán)色，在光學(xué)顯微鏡下以10×10的倍數(shù)來觀察得細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)，可由公式計算出細(xì)胞活力。圖2：細(xì)胞Trypen Blue染色后圖片（10x10）下面是我們小組的實驗結(jié)果：表1：總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計表（10×10）項目總細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)細(xì)胞活力11142320.2%21172521.4%31483020.3%41002121.0%總計4799920.7%計算得其細(xì)胞活力為20.7%八、 分析總結(jié)本次實驗中我們小組所測細(xì)胞活力為20.7%，并不算高，分析得應(yīng)有以下原因可能影響實驗結(jié)果（包括誤差）：a) 若在無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致染菌，會極大的影響觀察，導(dǎo)致實驗失敗；b) 若在離心分離呈單細(xì)胞的過程中離心機(jī)轉(zhuǎn)