DNA測(cè)序技術(shù)(1)

1、整理ppt1第二代DNA測(cè)序技術(shù) 神經(jīng)生物學(xué) 整理ppt2 第二代DNA測(cè)序技術(shù)包括：Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù) 核心思想：邊合成邊測(cè)序 特點(diǎn)：讀長(zhǎng)短、通量高，成本低、測(cè)序快整理ppt3 454技術(shù) Roche 454測(cè)序系統(tǒng)是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營(yíng)二代測(cè)序技術(shù)的平臺(tái)測(cè)序原理：焦磷酸測(cè)序法4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 焦磷酸測(cè)序法反應(yīng)體系：1個(gè)特異性的測(cè)序引物和單鏈DNA模板，4種酶混合物（DNA聚合酶、硫酸化酶、熒光素酶、雙磷酸酶）和底物混合物（包括APS和熒光素）。整理ppt4焦磷酸測(cè)序法原理及步驟

2、 第一步：向反應(yīng)體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA 聚合酶的作用下，發(fā)生以下反應(yīng) 第二步：上一步中生成的PP i和APS在硫酸化酶的催化下生成ATP，ATP可使熒光素酶催化熒光素向氧化熒光素轉(zhuǎn)化，同時(shí)產(chǎn)生可見光，光信號(hào)強(qiáng)弱與ATP含量成正比，又n（ATP）=n（PP i）=n（加入的dNTP），因此可根據(jù)光信號(hào)強(qiáng)弱推知加入的dNTP的個(gè)數(shù)第三步：反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在雙磷酸酶的作用下降解第四步：加入另一種dNTP,使第2-4步反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息整理ppt5 （1）DNA文庫(kù)制備：將待測(cè)DN

3、A打斷成300-800bp長(zhǎng)的小片段，末端修復(fù)后在片段兩端加上不同的接頭，變性處理回收單鏈DNA。 （2）體外DNA擴(kuò)增：454系統(tǒng)采用的是乳化PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增。整理ppt6 （3）富集固定：將含有DNA片段的磁珠富集起來，并將這些磁珠置于一種PTP平板中的特制小孔中，每個(gè)孔只能容納一個(gè)磁珠。 （4）測(cè)序：采用焦磷酸測(cè)序法，每個(gè)含有磁珠的小孔都可以測(cè)出其中一個(gè)片段的序列。整理ppt7 Illumina測(cè)序 Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測(cè)序機(jī)器 測(cè)序原理：類似Sanger測(cè)序法，dNTP的3-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，并帶有堿基特異熒光標(biāo)記，因

4、而每次只能添加一個(gè)dNTP，放出一個(gè)熒光信號(hào)。整理ppt8 （1）DNA文庫(kù)制備：把待測(cè)的DNA樣本打斷成小片段，兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫(kù) （2）體外DNA擴(kuò)增：整理ppt9 （3）測(cè)序：加入測(cè)序試劑，在合成連結(jié)合一個(gè)堿基后，洗脫掉游離的dNTP，然后在檢測(cè)熒光信號(hào)后加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3-OH保護(hù)基團(tuán)，以此為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)這個(gè)循環(huán)即可測(cè)出該片段序列。整理ppt10 Solid測(cè)序技術(shù)是第二代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。 測(cè)序原理：基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測(cè)序。整理ppt11 合成新鏈所用酶：DNA連接酶 底物：8堿基單鏈熒光探針混合

5、物3-XXnnnzzz-5，根據(jù)XX的不同在探針的5末端分別標(biāo)記了4種顏色的熒光染料 當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對(duì)而連接上時(shí)，就會(huì) 發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號(hào)整理ppt12整理ppt13整理ppt14Solid技術(shù)測(cè)序流程 （1）DNA文庫(kù)構(gòu)建：片段打斷，并在片段兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。 （2）體外擴(kuò)增：乳化PCR，磁珠直徑約1um，在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3端進(jìn)行修飾（為后面測(cè)序做準(zhǔn)備） （3）磁珠富集轉(zhuǎn)至測(cè)序玻片 （4）連接法測(cè)序整理ppt15三種平臺(tái)的技術(shù)差異454技術(shù)Illimina測(cè)序Solid技術(shù)體外PCR擴(kuò)增方法磁珠乳化PCR（磁珠直徑約28um）橋式PCR磁珠乳化PCR（磁珠直徑約1um）測(cè)序原理焦磷酸測(cè)序法可逆終止物測(cè)序（類似Sanger測(cè)序法）連接法