重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹

1、活性蛋門帑體方案德泰生物Detal Biologies重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹關(guān)鍵詞：重組蛋白表達，蛋白表達純化，蛋白表達描述：本文旨在介紹蛋白分離純化時的處理策略，注意事項以及純化方法等，并附有純化案例介紹。分離純化處J運組蛋白農(nóng)達的卜游處理（downstream processing）階段，且與上游過程緊密相聯(lián)，如是否帶 冇親和標(biāo)簽，是否進行分泌表達等。所以在對R的蛋口表達純化時，要統(tǒng)一考渥和整體設(shè)計，并充分考慮上游對卞 游的影響。同時，不同的表達系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響卜游的處理過程：冃的蛋白表達是否形成包涵體，忖的蛋白表 達定位（胞內(nèi)、細胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細胞外）表達策略優(yōu)點缺

2、點分泌表達至細胞外増強正確二硫鍵的形成 降低蛋白酶對表達蛋白的降解 可獲得確定的N末端顯著減少雜蛋白水平，簡化純化 不需耍細胞破碎表達水平低多數(shù)蛋白不能進行分泌表達 表達蛋白需要濃縮細胞周質(zhì)空間農(nóng)達増強二硫鍵正確形成 可獲得確定N木端 顯著減少雜蛋口水平，簡化純化一些蛋白不能分泌進入周質(zhì)空間 沒白人規(guī)模選擇性地釋放周質(zhì)空間 蛋白的技術(shù)周質(zhì)蛋白爾可引起重組蛋白的酚解細胞內(nèi)包涵體表達包涵體易于分離 保護蛋白質(zhì)不被降解需耍體外的折徨和溶解，的率較低 具有不確定N末端細胞內(nèi)可溶性蛋門衷達蛋白質(zhì)不具有活性，対宿主細胞生長沒有人影響， 通?？色@得高衷達水平不需耍體外溶解和折栓一般具有正確的結(jié)構(gòu)和功能高水平

3、的表達難以得到 需要復(fù)雜的純化 可發(fā)生蛋白質(zhì)酶解 具有不確定N末端山上農(nóng)可知選擇將所表達的蛋白分泌到細胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細胞的步驟，而且細胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的 蛋I種類較少,目的蛋白易純化而在細胞質(zhì)內(nèi)表達重組蛋白時,直組蛋白通常是可溶性表達,但也易形成包涵體。 可溶性蛋口往往需耍復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易J：分離H.純度較高，但冋收H有生物活性的蛋門質(zhì)卻變得相肖閑 難，通常需耍對聚集的蛋白進行變，復(fù)性，而通常情況卜活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借筋年的蛋門衣達服 務(wù)操作經(jīng)驗和相關(guān)的技術(shù)，可以提供可溶性巫組蛋門保證型服務(wù)和更高純度的上清蛋門。分離純化原則總結(jié)： 應(yīng)盡可能利用蛋口質(zhì)不同物理特

4、性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同技術(shù)多次純化：（2）不同的蛋白在性質(zhì)上有很人區(qū)別，每一步純化步驟都應(yīng)當(dāng)充分利用I的蛋白和朵質(zhì)成分物理性質(zhì)差異,在純化早期階段耍盡量減少處理體積，方便后續(xù)純化；G）在純化厲期階段，再使用造價高的純化方法，冇利純化材料的亞復(fù)使用，減少再生復(fù)雜性。色譜法分離純化蛋白質(zhì)色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質(zhì)的羞異而建立起來的技術(shù)。所仃的色譜系統(tǒng)都由倆個相組成：固定網(wǎng)如:： El德泰生物目 DetaiBiol。陽活性蛋白整體方案相(固體物質(zhì)或周定J：固體物質(zhì)上的成分)和流動相(水和其他溶劑)。肖待分離的混合物隨流動相通過固體相時, 各組分與倆相發(fā)生相互作用(吸附，

5、溶解，結(jié)合)并因作用力的不同導(dǎo)致流出時間上的差異，分部收集流出液，町 以得到樣品中所含的各單一組分，從而達到分離各組分的目的。色譜層析分離純化蛋質(zhì)冇多種方法，包括凝膠過濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色i曽高效液相色譜 等。其中親和色譜在幣:組蛋白純化中的應(yīng)用中最為廣泛。親和色譜原理親和色譜是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間H有的特異性親和力，從ifu達到分離的口的。即將一對能町逆 結(jié)合和解離生物分了的力作為配叢，仃人孔徐、殺水性的同相駛體相偶聯(lián)、制成專一的殺和吸附劑片城允色 譜柱，使紂樣品混介物流經(jīng)色譜柱時，與親和配風(fēng)能結(jié)介的物質(zhì)就被選擇性地吸附下來，而H他的蛋門質(zhì)及雜質(zhì)不 被吸附，從色

6、譜柱中流出，使用適肖的緩沖液使被分離物質(zhì)與配皋解吸附，即可獲得純化的冃的產(chǎn)物。親和色譜貝有高選擇性，高分辨率和高容最的特點，并H親和色譜純化過程簡單，迅速，IL分離效率高。并且 可用J純化生物人分子、稀溶液的濃縮、不穩(wěn)定蛋口的貯藏、從純化分子中除去殘余汚染物等。但其必須針對某一 分離對彖，制備專一的配基和尋求穩(wěn)定色譜的條件，且成木較高。實驗案例(從邑co中提取誘導(dǎo)表達的GST標(biāo)簽融合蛋白)簡介谷胱廿肽S轉(zhuǎn)移M (GST)親和標(biāo)簽是純化匝組蛋門的常用方法，該方法以GST能夠偶聯(lián)在介質(zhì)上的谷胱甘 肽配體結(jié)合為基礎(chǔ)。同時，帶令GST的蛋白與配體結(jié)合是可逆的，能夠在溫和，非變性的條件卜通過加入還原型

7、谷胱廿肽被洗脫下來。材料BL21感受態(tài)細胞PGEX表達敬體LB培養(yǎng)基Amp (氨節(jié)青密素)IPTG蛋白酶抑制劑緩沖液 1 (100mmol/L Tris, PH 8.5, 500mmol/L NaCI)緩沖液 2 dOOmmol/LNaAc, PH 4.5, 500mmol/L NaCI)PBS 緩沖液(100mmol/L NaCI 2.7mmol/L KCL 10mmol/L Na2HPO4. 1.8mmol/L KH2PO4)洗脫緩沖液(50mmol/LTris, PH 8.0,1 Ommol/L GSH)微量紫外分光光度計超聲波破碎儀高速冷凍離心機GST柱方法我體構(gòu)建和細繭培養(yǎng)1) 采用

8、RT-PCR擴增得到冃的基因，構(gòu)建到表達載體(PGEX-4T-1)上；網(wǎng)址：RS|德泰生物目 DetaiBiol。陽活性蛋白整體方案2）用構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21, LB平板37*C；3）LB平板上挑取單一胡落接入5mLLB培養(yǎng)基（100ug/mL Amp）屮，37C培養(yǎng)35h；4）將5mL茵液接入1LLB 100ug/mLAmp）液體培養(yǎng)基巾37°C培養(yǎng)至OD6o=0-6,加入d3mmol/L的IPTG, 16°C 誘導(dǎo) 16h；5）將培養(yǎng)好的菌液i 5000r/min離心10min,棄去上清液，收集I宥體，離心后繭體沉淀懸浮J： 25mL Binding buffer

9、 中2一細胞破碎和蛋白分離1）往懸浮好的菌液中加入適帚蛋白抑制劑（10uL的10mg/mLantipain, 10uL的10mg/mLleupeptin和1mL 的1mol/LPMSF）,冰浴放置：2）超聲破碎，每個循環(huán)26次，超川6s,間隔5s,視破碎效果共24個循環(huán)，破碎后的菌體1800r/min 離心30min,上清保持在4*C：3）GST柱先用PBS緩沖液平衡，上樣結(jié)介3060min,每5-10m泊攪扌*一次，流干；4）用23倍體積PBS緩沖液平衡清洗非特異性蛋白，流干，加入15mL洗脫緩沖液洗脫；5）由J殘存少最蛋白幽，洗脫出來的目的蛋白溶液可j-4r保存兒小時；6）SDS-PAGE檢測初步純化效果，進行下一步純化步驟。3蛋白檢測和GST柱的恢復(fù)1）用3倍柱體積的6mol/L鹽酸恥處理柱子10min；2）用3倍柱體積的水洗柱23次；3）用3倍柱體積的緩沖液1處理柱子10min；4）用3倍柱體積的緩沖液2處理柱子10min；5）再次取復(fù)3, 4步驟倆次；6）用3倍柱體積的水洗柱23次；7）用3倍柱體積的PBS緩沖液洗柱2次；8）往柱內(nèi)加3倍體積PBS待用。4問題分析及解決方案GST標(biāo)簽蛋白不結(jié)介柱子或結(jié)介能力非常圳的原因儀解決辦法氐因1）過分的機械裂無使標(biāo)簽蛋白表性，陰止結(jié)介；2）GST標(biāo)簽蛋白在樣骷中