秦嶺大熊貓IFN-γ基因的克隆、表達(dá)及免疫活性研究

1、秦嶺大熊貓IFN-基因的克隆、表達(dá)及免疫活性研究    英文題名 Gene Cloning、Expression and Bioactivation Detection of Ailuropoda Melanoleuca Qinlingensis IFN-  關(guān)鍵詞 秦嶺大熊貓; IFN-基因; 克隆; 表達(dá); 生物學(xué)活性; 英文關(guān)鍵詞 Giant Panda Qinling; interferon-gene; expression; bioactivity; 中文摘要 干擾素-(Interferon-gamma,IFN-)是一種具有抗病毒、抗

2、腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用,是機(jī)體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分,因此,IFN-在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測(cè)等方面起著重大作用。 大熊貓(AiluroPoda melanoleuca)是我國(guó)特有的珍稀野生動(dòng)物。據(jù)國(guó)家林業(yè)總局最新公布的調(diào)查數(shù)字,野生大熊貓現(xiàn)存數(shù)量在1590只左右,人工圈養(yǎng)的大熊貓也僅有189只。其中秦嶺大熊貓亞種,其總數(shù)大約273只,它們?nèi)蕴幱诮^滅的邊緣。由于野生條件的惡劣引發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良,免疫力低下,加之各種病原微生物的侵襲,最終導(dǎo)致機(jī)體衰竭而死及長(zhǎng)期人工圈養(yǎng)的大熊貓(特別是幼年大熊

3、貓和老齡化大熊貓)大多免疫力低下,抗病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的能力相對(duì)較弱。而對(duì)其疾病的防治目前仍以藥物控制為主,并無(wú)專用疫苗,加上頻繁用藥導(dǎo)致耐藥性菌(蟲)株出現(xiàn),以及藥物自身存在的毒副作用,這些都給大熊貓的疾病防治及繁殖工作帶來(lái)了很大的難度。因而為進(jìn)一步搞好大熊貓的飼養(yǎng)管理及疾病控制,需要研究新的防治技術(shù)和藥物,通過(guò)IFN-來(lái)改. 英文摘要 Interferon-gamma(IFN-)secreted by T lymphocytes and natural killer(NK)cells is an anti-viral and anti-tumor proliferation and i

4、mmunoregulatory cytokine 摘要 4-5 ABSTRACT 5-6 第一章 IFN-研究進(jìn)展 10-19     1.1 IFN-的發(fā)現(xiàn) 10     1.2 IFN-的產(chǎn)生及分子結(jié)構(gòu) 10-12     1.3 IFN-受體及作用機(jī)制 12-14     1.4 IFN-主要生物學(xué)功能 14-16         1.4.1 抗病毒作用 14    &#

5、160;    1.4.2 免疫調(diào)節(jié)作用 14-15         1.4.3 抗腫瘤作用 15-16     1.5 IFN-的基因工程研究進(jìn)展 16-17     1.6 IFN-在動(dòng)物疾病防控中的作用 17-18     1.7 存在的問(wèn)題和展望 18-19 第二章 秦嶺大熊貓的進(jìn)化史等研究進(jìn)展 19-24     2.1 秦嶺大熊貓的進(jìn)化史 19-20  &

6、#160;  2.2 秦嶺大熊貓形態(tài)特征 20     2.3 秦嶺大熊貓生活習(xí)性 20-21     2.4 秦嶺大熊貓分布地域 21     2.5 秦嶺大熊貓分子學(xué)研究進(jìn)展 21     2.6 秦嶺大熊貓保護(hù)措施 21-22     2.7 大熊貓疾病研究概況 22     2.8 大熊貓IFN-研究的目的和意義 22-24 第三章 秦嶺大熊貓IFN-基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 24-45  

7、   3.1 材料 24-27         3.1.1 菌種和載體 24         3.1.2 主要試劑 24         3.1.3 主要儀器 24-25         3.1.4 主要溶液配方 25-27     3.2 方法 27-37  

8、;       3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 27-28         3.2.2 秦嶺大熊貓外周血淋巴細(xì)胞的分離與誘導(dǎo)培養(yǎng) 28         3.2.3 淋巴細(xì)胞總RNA 的提取及第一鏈cDNA 的合成 28         3.2.4 PCR 擴(kuò)增 28-29      

9、;   3.2.5 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳 29-30         3.2.6 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收 30         3.2.7 目的片段與載體的連接 30         3.2.8 感受態(tài)細(xì)胞的制備 30-31         3.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 31  

10、60;      3.2.10 菌液PCR 鑒定 31-32         3.2.11 堿裂解法小量提取質(zhì)粒 32         3.2.12 重組質(zhì)粒的鑒定 32-33         3.2.13 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 33-35         3.2.14

11、重組質(zhì)粒的鑒定 35         3.2.15 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) 35         3.2.16 重組菌最佳誘導(dǎo)條件的確定 35-36         3.2.17 表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 36-37     3.3 結(jié)果 37-42         3.3.1 RT-nested PCR

12、 擴(kuò)增結(jié)果 37         3.3.2 重組質(zhì)粒pGEM-T-IFN-的測(cè)序結(jié)果與序列分析結(jié)果 37-38         3.3.3 重組表達(dá)載體pET32a-IFN-的鑒定 38-40         3.3.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳檢測(cè) 40-41         3.3.5 表達(dá)條件的優(yōu)化 4

13、1         3.3.6 Western blot 分析 41-42     3.4 討論 42-44         3.4.1 秦嶺大熊貓IFN-基因的擴(kuò)增 42         3.4.2 秦嶺大熊貓IFN-基因表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 42         3.4.3 目的蛋白的表

14、達(dá) 42-43         3.4.4 表達(dá)條件的優(yōu)化 43         3.4.5 重組蛋白的大小及表達(dá)量 43-44         3.4.6 重組蛋白的反應(yīng)原性鑒定 44     3.5 小結(jié) 44-45 第四章 IFN-重組蛋白的純化 45-50     4.1 材料 45    

15、     4.1.1 主要試劑 45         4.1.2 主要儀器設(shè)備 45         4.1.3 用于蛋白純化溶液的配制 45     4.2 方法 45-47         4.2.1 重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá) 45        

16、 4.2.2 目的蛋白存在情況檢測(cè) 45-46         4.2.3 鎳柱的處理 46         4.2.4 鎳柱的再生 46         4.2.5 目的蛋白的純化 46-47         4.2.6 純化蛋白的濃縮 47       &

17、#160; 4.2.7 重組蛋白濃度的測(cè)定 47     4.3 結(jié)果 47-48         4.3.1 重組蛋白的制備及純化 47-48         4.3.2 重組蛋白濃度的計(jì)算 48     4.4 討論 48-49         4.4.1 目的蛋白存在形式檢測(cè) 48-49    

18、;     4.4.2 目的蛋白的純化 49     4.5 小結(jié) 49-50 第五章 重組IFN-蛋白多克隆抗體制備及其活性檢測(cè) 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50         5.1.2 主要儀器設(shè)備 50     5.2 方法 50-51   

19、;      5.2.1 多克隆抗體制備 50         5.2.2 重組蛋白活性檢測(cè) 50-51     5.3 結(jié)果 51-53         5.3.1 抗體制備結(jié)果 51         5.3.2 重組蛋白活性檢測(cè)結(jié)果 51-53     5.4 討論 53-5

20、4         5.4.1 多克隆抗體制備 53         5.4.2 抗體檢測(cè)方法 53-54         5.4.3 重組蛋白活性檢測(cè) 54     5.5 小結(jié) 54-55 結(jié)論 55-56 參考文獻(xiàn) 56-62 附錄 62-63     4.5 小結(jié) 49-50 第五章 重組IFN-蛋白多克隆抗體制備及其活

21、性檢測(cè) 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50         5.1.2 主要儀器設(shè)備 50     5.2 方法 50-51         5.2.1 多克隆抗體制備 50         5.2.2

22、 重組蛋白活性檢測(cè) 50-51     5.3 結(jié)果 51-53         5.3.1 抗體制備結(jié)果 51         5.3.2 重組蛋白活性檢測(cè)結(jié)果 51-53     5.4 討論 53-54         5.4.1 多克隆抗體制備 53       

23、;  5.4.2 抗體檢測(cè)方法 53-54         5.4.3 重組蛋白活性檢測(cè) 54     5.5 小結(jié) 54-55 結(jié)論 55-56 參考文獻(xiàn) 56-62 附錄 62-63     4.5 小結(jié) 49-50 第五章 重組IFN-蛋白多克隆抗體制備及其活性檢測(cè) 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24、 50         5.1.2 主要儀器設(shè)備 50     5.2 方法 50-51         5.2.1 多克隆抗體制備 50         5.2.2 重組蛋白活性檢測(cè) 50-51     5.3 結(jié)果 51-53         5.3.1

25、抗體制備結(jié)果 51         5.3.2 重組蛋白活性檢測(cè)結(jié)果 51-53     5.4 討論 53-54         5.4.1 多克隆抗體制備 53         5.4.2 抗體檢測(cè)方法 53-54         5.4.3 重組蛋白活性檢測(cè) 54  

26、60;  5.5 小結(jié) 54-55 結(jié)論 55-56 參考文獻(xiàn) 56-62 附錄 62-63     4.5 小結(jié) 49-50 第五章 重組IFN-蛋白多克隆抗體制備及其活性檢測(cè) 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50         5.1.2 主要儀器設(shè)備 50     5.2 方法 50-51 &#

27、160;       5.2.1 多克隆抗體制備 50         5.2.2 重組蛋白活性檢測(cè) 50-51     5.3 結(jié)果 51-53         5.3.1 抗體制備結(jié)果 51         5.3.2 重組蛋白活性檢測(cè)結(jié)果 51-53     5.4 討論 53-54         5.4.1 多克隆抗體制備 53         5.4.2 抗體檢測(cè)方法 53-54