急性毒性試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一 急性毒性試驗(yàn) (Acute Cytotoxicity Test)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私馍锊牧霞毙远拘缘暮x，掌握急性毒性試驗(yàn)的基本方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理： 醫(yī)學(xué)上通常指的急性毒性試驗(yàn)是對(duì)藥物而言的，并以半數(shù)致死量（median lethal dose, LD50）來衡量藥物急性毒性的大小。所謂LD50是指某一藥物使試驗(yàn)動(dòng)物總體死亡一半的劑量，由于LD50是劑量反應(yīng)曲線上最敏感的一點(diǎn)，而且有易測(cè)、準(zhǔn)確和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，以此作為藥物使用的安全指標(biāo)。但對(duì)于生物材料而言，它與藥物在體內(nèi)的反應(yīng)機(jī)理不同，大多數(shù)生物材料不能計(jì)算LD50，所以在試驗(yàn)過程中，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)物靜脈或腹腔注射試驗(yàn)材料或

2、其浸提液來觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重在24、48和72h的變化、運(yùn)動(dòng)、呼吸狀態(tài)以及死亡情況作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)，判定某種生物材料的急性毒性作用。三、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：小鼠四、實(shí)驗(yàn)器材和藥品：聚甲基丙烯酸羥乙酯（PHEMA），蒸餾水，生理鹽水（0.9），注射器（1ml），量筒（10ml），小燒杯（50、100ml），高壓消毒器。五、實(shí)驗(yàn)步驟：1浸提液制備：按評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)裁剪試樣，選擇適當(dāng)浸提溫度制備浸提液。2將10只體重在1723g間的健康、未做過其他實(shí)驗(yàn)的小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。 3將浸提液按每公斤小鼠體重注射50ml于實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈（50ml/kg），用生理鹽水按同樣方法作空白對(duì)照。 4記錄試樣表面積和

3、使用浸提液的容量；記錄注射后24h、48h、72h兩組小鼠的體重，觀察其各種生物學(xué)反應(yīng)情況。六、評(píng)價(jià)方法：1 注射后動(dòng)物反應(yīng)觀察指標(biāo)：程 度癥 狀無毒輕度毒性明顯毒性重度毒性死亡未見毒性癥狀輕度癥狀，但無運(yùn)動(dòng)減少、呼吸困難或腹部刺激癥狀有腹部刺激癥狀、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)減少、眼瞼下垂、腹瀉、體重下降衰竭、震顫、嚴(yán)重腹部刺激癥狀、眼瞼下垂、呼吸困難、體重下降注射后死亡2結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：21 在72h觀察期內(nèi)，注射材料浸提液的動(dòng)物反應(yīng)不大于對(duì)照組動(dòng)物，則認(rèn)為該材料符合急性毒性試驗(yàn)要求。22在72h觀察期內(nèi)，注射材料浸提液動(dòng)物中有2只以上出現(xiàn)輕度毒性癥狀或僅1只動(dòng)物出現(xiàn)明顯毒性癥狀死亡，或?qū)嶒?yàn)組5只動(dòng)物的

4、體重均下降，即使無其他中毒癥狀都要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。23 重復(fù)試驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)量應(yīng)加倍，即每組需10只小鼠。浸提液應(yīng)該重新制備。重復(fù)試驗(yàn)若符合21 項(xiàng)要求，則認(rèn)為該材料合格。24 如實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物有2只以上發(fā)生死亡或3只以上出現(xiàn)明顯毒性癥狀或動(dòng)物普遍出現(xiàn)進(jìn)行性體重下降，則不需要重復(fù)試驗(yàn)，可認(rèn)為該材料不符合急性毒性試驗(yàn)要求。附：小鼠靜脈注射方法小鼠的尾部有三條靜脈，一般采用兩側(cè)的靜脈。把動(dòng)物固定在暴露尾部的固定器內(nèi)（可用燒杯、鐵絲罩或粗試管鄧物代替固定器）。拔去尾部靜脈走向的毛，置尾巴于40500C 溫水中浸泡幾分鐘，或用75乙醇棉球反復(fù)擦抹，使尾部血管擴(kuò)張。行尾部注射時(shí)，盡量采用與尾部平行的角度進(jìn)針，抽吸

5、法不能驗(yàn)證是否穿刺成功，開始注藥時(shí)應(yīng)盡量緩慢，仔細(xì)觀察，如果有白色皮丘出現(xiàn)，說明未刺入血管，應(yīng)重新向尾部方向移動(dòng)針頭，再次穿刺，直至注射時(shí)無皮丘出現(xiàn)，才能正式注射藥物，有時(shí)在注射藥物的同時(shí)可見靜脈血被進(jìn)去的藥物向前推進(jìn)。實(shí)驗(yàn)二 致熱源試驗(yàn) (hypersusceptibility test)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩聼嵩磳?shí)驗(yàn)的基本方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理：致熱源試驗(yàn)是通過被測(cè)材料或其浸提液注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，若浸提液存在熱源物質(zhì)，作用于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞后，促使其產(chǎn)生內(nèi)出性熱源，作用于丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，使動(dòng)物體溫上升，因此，觀察動(dòng)物的體溫變化可用來判斷該材料或其浸提液中所含熱源量是否符合人體的要

6、求。三、 實(shí)驗(yàn)對(duì)象： 兔四、實(shí)驗(yàn)器材和藥品：硅橡膠、蒸餾水、生理鹽水（0.9）、注射器（50ml）、燒杯(150ml)、量筒（100ml）、高壓消毒器、體溫計(jì)（肛測(cè)）。五、實(shí)驗(yàn)步驟：1 浸提液制備：1.1將所有與浸提液接觸的容器、量器等玻璃器皿均應(yīng)先置于干燥箱內(nèi)250加熱30min，或180加熱2h去除熱原物質(zhì)。1.2 浸提液所用滅菌0.9生理鹽水應(yīng)是熱原檢查合格者，試樣浸提前應(yīng)用同一批號(hào)滅菌的0.9生理鹽水溶液沖洗3次。1.3 按評(píng)價(jià)要求裁剪試樣，選擇適當(dāng)?shù)慕釡囟全@得浸提液。按評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)裁剪試樣，先用清水洗凈，再用蒸餾水沖洗三次，用生理鹽水沖洗一次，置于燒杯中，按試樣與浸提介質(zhì)比例注入適量的

7、生理鹽水，封口。2 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備：21 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：選用健康、成年的新西蘭兔，體重2.53.0kg。22 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)前的要求：試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行體溫測(cè)量，在體溫測(cè)量前7日應(yīng)在同一條件下使用同一飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，使其在此期間體重不減輕，精神、食欲、排泄等不應(yīng)有異?，F(xiàn)象。在試驗(yàn)前12日，應(yīng)讓試驗(yàn)用兔盡可能處于同一溫度環(huán)境中，飼養(yǎng)室和試驗(yàn)室的溫度也盡可能相同。在試驗(yàn)過程中，應(yīng)注意溫度變化不得太大，應(yīng)避免兔躁動(dòng)并停止給食2h以上。23 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體溫測(cè)量：在實(shí)驗(yàn)前7日內(nèi)預(yù)測(cè)體溫，每隔1h測(cè)量體溫一次，共測(cè)4次，4次體溫均在38.338.60C之間，最高和最低的體溫差數(shù)不超過0.40C。24 體

8、溫測(cè)量方法和時(shí)間：選用肛溫計(jì)測(cè)量直腸內(nèi)溫度，肛溫計(jì)插入深度一般約為6cm左右，時(shí)間510min。3 試驗(yàn)過程：31選用3只符合要求的試驗(yàn)兔，測(cè)定其正常體溫后15min內(nèi)，自耳靜脈緩慢注入試驗(yàn)材料浸提液，劑量為10ml/kg，液體溫度為370C。32 注射后每隔1h測(cè)量兔體溫1次共測(cè)3次，以3次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔的升高度數(shù)。六、結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：1在試驗(yàn)的3只試驗(yàn)兔中，體溫升高均在0.60C以下，并且體溫升高總度數(shù)在1.40C以下，則認(rèn)為試驗(yàn)材料浸提液符合熱源檢查要求。2若3只試驗(yàn)兔中僅有1只體溫升高0.60C或0.60C以上，或3只試驗(yàn)兔體溫均低于0.60C，但升高總數(shù)在1.4

9、0C或1.40C以上時(shí)，應(yīng)另取5只兔復(fù)試。在復(fù)試的5只兔中，體溫升高0.60C或0.60C以上的總數(shù)僅有1只,，并且初復(fù)試合并8只試驗(yàn)兔的體溫升高總數(shù)不超過3.50C時(shí)，則認(rèn)為試驗(yàn)材料浸提液符合熱源檢查要求。3 若初試的3只試驗(yàn)兔中，體溫升高0.60C或0.60C以上的兔數(shù)超過1只時(shí),或在復(fù)試的5只試驗(yàn)兔中，體溫升高0.60C或0.60C以上的兔數(shù)超過1只時(shí),或在初復(fù)試合并8只兔的體溫升高超過3.50C，均認(rèn)為試驗(yàn)材料浸提液不符合熱源檢查的要求。4 將所有溫度下降的反應(yīng)都計(jì)為無溫度上升。 注：兔正常體溫為39.0(38.539.50)附：兔耳靜脈注射方法兔一般采用耳緣靜脈。兔耳中央為動(dòng)脈，內(nèi)外

10、緣為靜脈。內(nèi)緣靜脈不易固定，很少選用。外緣靜脈表淺易固定，常用作注射部位。注射時(shí)先拔去注射部位的皮毛，用手指彈動(dòng)或輕柔兔耳，使靜脈充盈。左手示指和中指尖夾住靜脈的近端，拇指繃緊靜脈的遠(yuǎn)端，環(huán)指及小指墊在下面，右手持注射器靠遠(yuǎn)心端刺入靜脈，針頭朝向近心端。當(dāng)穿刺成功后，移動(dòng)拇指于針頭上，將兔耳與針頭牢固捏在一起，放松示指和中指，將藥注入后，拔出針頭，用手指壓迫針眼直至不流血為止，不可用中央動(dòng)脈注射藥物，以免藥物損傷兔耳。實(shí)驗(yàn)三 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)（Stimulation in Skin Test） 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆掌?nèi)刺激試驗(yàn)的基本操作。二、實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)通過皮內(nèi)注射生物材料的浸提液，觀察局部皮膚

11、反應(yīng)以評(píng)價(jià)生物材料浸提液是否具有潛在的非特異性急性刺激作用。該試驗(yàn)為一高敏感性試驗(yàn)，可廣泛用于評(píng)價(jià)與人體各部分接觸的生物材料的可瀝濾物質(zhì)非特異性急性毒性作用。通常采用試驗(yàn)材料或其浸提液在動(dòng)物或人體合適的部位進(jìn)行試驗(yàn)，按試驗(yàn)部位形成的紅斑、疤痕和水腫程度來衡量材料的刺激性。三、實(shí)驗(yàn)對(duì)象：家兔四、 實(shí)驗(yàn)器材和藥品：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，蒸餾水，生理鹽水，蓖麻油，注射器（2ml）、燒杯（50ml）五、 實(shí)驗(yàn)步驟：1 浸提液制備：2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和要求：21 健康家兔，不限性別，體重2.02.5kg，皮膚光滑，無任何皮膚疾病或損傷，未做過任何實(shí)驗(yàn)。22 在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)精心喂養(yǎng)和護(hù)理，條件環(huán)境

12、基本穩(wěn)定。23 本實(shí)驗(yàn)需要3只兔子，若實(shí)驗(yàn)結(jié)果可疑，則需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。3 實(shí)驗(yàn)方法：31 以脊柱為中線，兩側(cè)剪剃兔毛25cm10cm大小，注意剪剃過程中避免造成任何損傷。32 清潔暴露的皮膚，酒精消毒。在一側(cè)選擇十個(gè)點(diǎn)，沒點(diǎn)間隔2cm，5個(gè)點(diǎn)注射生理鹽水浸提液，另5個(gè)點(diǎn)注射空白對(duì)照液。同法在另一側(cè)選擇十個(gè)點(diǎn)，5個(gè)點(diǎn)注射植物油浸提液，另5個(gè)點(diǎn)注射植物油空白對(duì)照液。各點(diǎn)注射劑量為0.2ml。4 結(jié)果觀察和記分：41在注射后立刻、24、48、72h觀察每隔注射部位及周圍組織反應(yīng)，包括充血、腫脹、壞死等。42皮內(nèi)刺激反應(yīng)記分標(biāo)準(zhǔn)：反 應(yīng)說 明記 分紅斑和焦痂形成無紅斑輕度紅斑（幾乎看不出）明顯紅斑中度紅

13、斑重度紅斑伴有輕度焦痂01234水腫形成無水腫輕度水腫（幾乎看不出）明顯水腫（邊緣明顯高出周圍皮面）中度水腫（腫接近1mm）重度水腫（腫超過1mm，面積超出紅斑區(qū)）01234總刺激評(píng)分8按記分標(biāo)準(zhǔn)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每個(gè)注射部位的紅斑和水腫反應(yīng)評(píng)分并記錄。六、 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：1 每只動(dòng)物對(duì)材料的原發(fā)刺激指數(shù)（P）： 各時(shí)間段反應(yīng)總分P觀察總數(shù)2 平均原發(fā)刺激指數(shù)（A P）： 所有動(dòng)物的PA P=實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)3根據(jù)計(jì)算結(jié)果，0.00.4分為無刺激，0.51.9分為輕度刺激。2.04。9分為中度刺激，5.08.0分為強(qiáng)刺激。附一：脫毛劑配方 1硫酸鈉8g溶于100ml水中。 2硫酸鈉3份，肥皂粉1份，

14、淀粉7份，加水調(diào)成糊狀。 3硫酸鈉1g，生石灰15g，加水100ml。（配方1、2適用于家兔和齒類動(dòng)物脫毛，配方3適用狗脫毛）附二：脫毛方法用脫毛劑前，要剪去他們部位的被毛，以節(jié)省脫毛劑。切不可用溫水浸潤(rùn)被毛，否則脫毛劑會(huì)順被毛流入皮內(nèi)毛根深處，損傷皮膚。動(dòng)物應(yīng)放在凹型槽等容器內(nèi)，以免脫毛劑及洗毛水四處流淌。用鑷子夾棉球或紗布團(tuán)蘸脫毛劑涂抹在已剪去被毛的部位，等35min后，用溫水洗去脫下的毛和脫毛劑。操作時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕，以免脫毛劑沾在實(shí)驗(yàn)操作人員的皮膚粘膜上，造成不必要的損傷。附三：皮內(nèi)注射方法： 固定動(dòng)物的方法和注射部位與皮下注射相同。即操作者用左手將動(dòng)物輕輕壓在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，將其頸背或側(cè)腹部皮

15、膚提起，用皮試針頭穿刺，針頭進(jìn)入皮膚淺層，不能左右擺動(dòng)時(shí)，即表明針頭在皮內(nèi)?；爻闊o回流后，仔細(xì)將藥物注入皮內(nèi)。注射后皮膚出現(xiàn)一白色小皮丘。拔針時(shí)左手拇、示指捏住進(jìn)針部位數(shù)分鐘，以防止藥物外漏。實(shí)驗(yàn)四 溶血試驗(yàn)（Hemolysis Test）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私馊苎幕靖拍詈腿苎囼?yàn)的基本原理，掌握檢測(cè)試樣材料對(duì)血液紅細(xì)胞的溶血作用及方法。二、試驗(yàn)原理：溶血是指血液中的紅細(xì)胞遇到相應(yīng)的抗體（例如溶血素）而特異結(jié)合耳形成抗原復(fù)合物，該復(fù)合物可使得紅細(xì)胞溶解，這種現(xiàn)象就叫做溶血。對(duì)于生物材料，特別是與血液接觸的生物材料，在體內(nèi)是一種異體物質(zhì)，當(dāng)與血液接觸時(shí)是否會(huì)使紅細(xì)胞造成損傷，使紅細(xì)胞溶解，即是否

16、有溶血作用，溶解程度如何？通過本實(shí)驗(yàn)對(duì)被檢測(cè)的生物材料或其浸提液進(jìn)行體外試驗(yàn)，以此來對(duì)該生物材料的體外溶血性進(jìn)行評(píng)價(jià)。三、實(shí)驗(yàn)器材和藥品：硅橡膠，聚氯乙烯， NaCl溶液（0.9），草酸鉀（2），兔血，離心機(jī)，水浴箱，分光光度計(jì)，小試管，吸管，比色皿四、實(shí)驗(yàn)步驟：1 制備新鮮抗血凝兔血：由新采的兔血20ml加2草酸鉀1ml制成新鮮抗血凝兔血。2 稀釋新鮮抗血凝兔血：取新鮮抗血凝兔血8ml，加0.9NaCl溶液10ml稀釋。3 稱取試樣，每份5g，共三份。4 將試樣裁成50mm×30mm小條，先用自來水沖洗，再用適量蒸餾水搖洗2次，每次約1min，瀝干，置于試管內(nèi)，加入0.9NaCl溶

17、液10ml，置于37水浴箱保溫30min。再加入稀釋兔血0.2ml，輕輕混勻，再在370C水浴箱中繼續(xù)保溫60min。5 取出試管，用離心機(jī)離心5min（750g，2500r/min）.6 陽性對(duì)照用10ml蒸餾水加稀釋兔血0.2ml，陰性對(duì)照用10ml 0.9NaCl溶液加稀釋兔血0.2ml，保溫條件與上述試管相同。7 分別吸取上清液移入比色皿中，用分光光度計(jì)在545nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。8如陰性對(duì)照管的吸收度大于0.03，此次試驗(yàn)應(yīng)放棄。陽性對(duì)照管的吸收度值為0.8±0.3。五、結(jié)果計(jì)算：試樣的溶血程度用表示，其計(jì)算公式如下： DtDnc ×100 DpcDncDt試樣

18、吸收度Dnc陰性對(duì)照吸收度Dpc陽性對(duì)照吸收度七、 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：1各試管和對(duì)照管的吸收度應(yīng)取三管的平均值。2 材料的溶血率5，則表明材料符合生物材料溶血試驗(yàn)要求，若溶血率>5，則預(yù)示該材料有溶血作用。附：一、兔耳緣靜脈穿刺采血法操作同兔耳緣靜脈給藥法相同。穿刺前殼用二甲苯或乙醇使耳部血管充分?jǐn)U張，穿刺成功后即可抽血。針頭可不連接注射器，直接讓血液滴在有抗凝劑的容器內(nèi)。二、兔耳中央動(dòng)脈采血法經(jīng)兔耳中央的一條較粗、顏色鮮紅的動(dòng)脈采血，每次可采到約15ml血，操作方法基本與靜脈采血法相同。有動(dòng)脈末端，順向心方向進(jìn)針，穿刺成功可見動(dòng)脈血進(jìn)入針管。取血完畢后注意止血。雖然穿刺前兔耳血管已充分?jǐn)U張

19、，但在穿刺過程中動(dòng)脈常發(fā)生較長(zhǎng)時(shí)間的痙攣性收縮，這時(shí)可稍等一下，待動(dòng)脈重新舒張后再抽吸。進(jìn)針部位從中央動(dòng)脈末端開始，不要在近耳邊根取血，因耳根部軟組織厚，血管略深，易穿透血管導(dǎo)致皮下出血。實(shí)驗(yàn)五 凝血試驗(yàn) (blood test)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^測(cè)定涂于試管內(nèi)壁的試驗(yàn)材料與血液接觸，以判斷該材料對(duì)全血凝固時(shí)間的影響。二、實(shí)驗(yàn)原理：血液凝固過程是一種發(fā)生在血漿中由許多凝血因子參加的生化酶促反應(yīng)，結(jié)果是使血液由液體狀態(tài)變成膠凍狀態(tài)。血液凝固可分為內(nèi)源性凝血和外源性凝血。內(nèi)源性凝血是指參加凝血過程的凝血因子全部存在于血漿中，即血管內(nèi)凝血；外源性凝血是指在組織因子參與下的血凝過程。本實(shí)驗(yàn)采用兔頸總動(dòng)

20、脈放血的方法取血，血液幾乎未與組織因子接觸，因此，凝血過程主要由內(nèi)源性凝血系統(tǒng)所發(fā)動(dòng)的。三、試驗(yàn)血源：新采取的兔血四、實(shí)驗(yàn)器材和藥品：注射器，試管，小燒杯，水浴箱，10氨基甲酸乙酯溶液，肝素，五、實(shí)驗(yàn)步驟：1試材制備：11將肝素涂于10mm×10mm玻璃試管內(nèi)壁，涂好后經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒。12將玻璃試管和涂有硅油的玻璃試管作為對(duì)照管。2采取新鮮兔血：用氨基甲酸乙酯溶液（1g/kg）將兔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。然后分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，上端用線結(jié)扎阻斷血流，下端夾上動(dòng)脈夾，在動(dòng)脈正中剪一小口，插入細(xì)塑料管，結(jié)扎插管備用取血用。3用注射器抽取兔血3ml，立即啟動(dòng)秒表記時(shí)。4棄去針頭，沿試管壁注入血液1ml，共三管，并置于37水浴箱內(nèi)。5取血4min后，每隔30s將試管傾斜（約30）一次，依次觀察1，2，3管，直至第3管血液成為凝膠狀（傾斜至90）不再流動(dòng)為止，記下所經(jīng)時(shí)間即為凝血時(shí)間。六、結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：凝血時(shí)間延長(zhǎng)1215min，表示試材與玻璃相比有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)六 動(dòng)態(tài)凝血試驗(yàn) (dynamic blood test)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏雇坑诓ＡП砻娴脑嚇优c血液接觸