抗生素微生物檢定法

1、抗生素微生物檢定法 本法系在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì)，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法。 抗生素微生物檢定包括兩種方法，即管碟法和濁度法。測(cè)定結(jié)果經(jīng)計(jì)算所得的效價(jià)，如低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%時(shí)，應(yīng)調(diào)整其估計(jì)效價(jià)，重新試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線法除外）。除另有規(guī)定外，本法的可信限率不得大于5%。  管碟法本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。（一）  基本設(shè)備、用具、試驗(yàn)材料及標(biāo)準(zhǔn)品1.   

2、    基本設(shè)備（1）      抗生素效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)室：室內(nèi)應(yīng)為半無(wú)菌，裝有紫外線燈，有固定的效價(jià)測(cè)定臺(tái)，臺(tái)面要求水平、防震。該室應(yīng)與稀釋抗生素溶液的工作室隔離，以防止空氣、地面污染抗生素。（2）      超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)應(yīng)放置在潔凈工作室或半無(wú)菌室內(nèi)。（3）      抑菌圈面積測(cè)量分析儀：該儀器裝有微處理機(jī)，可自動(dòng)測(cè)量抑菌圈面積，并打印出統(tǒng)計(jì)分析的各種數(shù)據(jù)。2.   

3、0;   用具（1）       玻璃雙碟：為硬質(zhì)玻璃制品，碟底內(nèi)徑約90mm，碟高1617mm，碟底面應(yīng)平，厚薄均勻無(wú)凹凸現(xiàn)象。新購(gòu)的雙碟應(yīng)按上述要求進(jìn)行檢查。檢查時(shí)可將雙碟底平放在水平臺(tái)上，每碟內(nèi)加入2ml染料液，仔細(xì)觀察碟底反映的顏色深淺是否一致，挑選底部平的雙碟，洗凈晾干，置高溫烘箱內(nèi)140160 干熱滅菌2小時(shí)后備用。（2）       陶瓦圓蓋：應(yīng)平，無(wú)凹凸現(xiàn)象。（3）       不

4、銹鋼小管：外徑7.8±0.1mm，內(nèi)徑6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差異不超過(guò)±25mg，鋼管內(nèi)外壁要求光潔，管壁厚薄要一致，兩端面要平坦光潔。（4）       小鋼管放置器：四孔和六孔各一臺(tái)。（5）       游標(biāo)卡尺：精密度0.02mm。（6）       滴管：管口應(yīng)細(xì)長(zhǎng)平滑，不得有缺口。3.     

5、;  試驗(yàn)材料（1）      培養(yǎng)基及其制備方法以下培養(yǎng)基、緩沖液制備時(shí)，均以115滅菌30分鐘。培養(yǎng)基    胨           5g         磷酸氫二鉀     3g         水

6、60;       1000ml牛肉浸出粉   3g         瓊脂       1520g     除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)PH使比最終的PH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)（用紙漿減壓濾過(guò)或紗布棉花濾過(guò)），調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.88.0或6.56.6，分裝，滅菌。    

7、 培養(yǎng)基    胨          6g          酵母浸出粉     6g         瓊脂      1520g牛肉浸出粉   1.5g    

8、;    葡萄糖         1g         水         1000ml除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調(diào)節(jié)PH使比最終的PH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.88.0或6.56.6，分裝，滅菌。培養(yǎng)基    胨 &

9、#160;      5g             氯化鈉       3.5g           葡萄糖        1g牛肉浸出粉    1.5g &#

10、160;     磷酸氫二鉀      3.68g        水      1000ml酵母浸出粉    3g         磷酸二氫鉀      1.32g除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)

11、節(jié)PH值使滅菌后為7.07.2，分裝，滅菌。培養(yǎng)基    胨          3g           酵母浸出粉         3g          水    &

12、#160;   1000ml葡萄糖      1g           瓊脂             1520g除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調(diào)節(jié)PH使其比最終的PH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為6.56.6，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。培養(yǎng)基

13、    胨            6g        酵母浸出粉          2g         瓊脂        1520g牛肉浸出粉&#

14、160;   2g        葡萄糖              3g         水          1000ml除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調(diào)節(jié)PH使其比最終的PH值略高0.20.4，加入瓊脂，

15、加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.88.0，分裝，滅菌。培養(yǎng)基    蛋白胨       7.5g        牛肉浸出粉     1.0g        葡萄糖      10.0g酵母膏     

16、  2.0g        氯化鈉         5.0g        水          1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過(guò)，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)值使滅菌后為6.5，分裝，滅菌。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基胨    

17、60;      10g         瓊脂         1520g        氯化鈉         5g肉浸液       1000ml(牛肉浸出粉3g,加水1000

18、ml，配成溶液代替)除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)PH使比最終的PH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過(guò)，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.27.4，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基胨          5.0g          葡萄糖        20.0g      

19、;   水         1000ml硫酸鎂       0.5g         酵母浸出粉      2.0g     磷酸氫二鉀     1.0g瓊脂      

20、 1520g     除葡萄糖和瓊脂外，混合上述成分，微溫溶解，調(diào)節(jié)PH值約為6.8，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過(guò)，加入葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。培養(yǎng)基可以采用相同成分的干燥培養(yǎng)基代替，臨用時(shí)，照使用說(shuō)明配制和滅菌，備用。注意事項(xiàng)：制備培養(yǎng)基的原材料，特別是胨、牛肉浸膏和瓊脂等對(duì)抑菌圈的大小與邊緣的清晰度有影響，故應(yīng)預(yù)先進(jìn)行試驗(yàn)，挑選使用。不得在操作抗生素的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配制培養(yǎng)基。配制培養(yǎng)基所用的器皿應(yīng)與接觸抗生素的器皿嚴(yán)格分開(kāi)，以免污染抗生素。培養(yǎng)基中的瓊脂用量要隨氣候冷暖不

21、同而增減。一般夏季用瓊脂的量比冬季多，其用量多少以培養(yǎng)基的硬度適宜為度。培養(yǎng)基在加熱煮沸后所蒸發(fā)的水分必須用蒸餾水補(bǔ)足。培養(yǎng)基滅菌后，應(yīng)放于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448小時(shí),證明無(wú)菌后方可使用。使用期限約為1個(gè)月，不宜保存過(guò)久，以免營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。制成的培養(yǎng)基倒入雙碟內(nèi)凝固后應(yīng)透明，不得有沉淀。（2）     緩沖液磷酸鹽緩沖液（PH6.0）：取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml,濾過(guò)，分裝，滅菌。磷酸鹽緩沖液（PH7.0）：曲磷酸氫二鈉9.39g與磷酸二氫鉀3.5g,加水使成1000ml，濾過(guò)，分裝，滅菌。磷酸鹽緩沖液（PH7.8）：取磷酸

22、氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過(guò)，分裝，滅菌。附注配制緩沖液所用化學(xué)試劑的規(guī)格應(yīng)為分析純?cè)噭＃?）試驗(yàn)用菌種：試驗(yàn)用菌種對(duì)被測(cè)定的抗生素應(yīng)具有高度的敏感性，在一般培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)繁殖，易于保存，不應(yīng)變異或變異性小，無(wú)致病性，具有敏銳的生化培養(yǎng)特性，能適合多種抗生素的檢定，最好是芽胞菌，因芽胞菌制備成懸液易于保存，不易變異，使用時(shí)間長(zhǎng)。試驗(yàn)用菌種的保存：衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所提供的菌種為冷凍干燥菌種，可保存在5的冰箱內(nèi)。以無(wú)菌操作啟開(kāi)凍干菌種，接種在普通瓊脂斜面上，置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2022小時(shí)。取出放至室溫后，放入5冰箱中保存，即為試驗(yàn)用菌種。試驗(yàn)用菌種每月

23、傳代一次，每季度平板分離一次。菌種的接種方法：從冰箱中取出菌種1支，放至室溫。另取新鮮制備的普通瓊脂斜面1支（如瓊脂斜面已干燥無(wú)凝結(jié)水者，則不可使用），注明菌名、接種日期，與菌種斜面一同放于預(yù)先用1新潔爾滅溶液擦拭過(guò)，并用紫外線燈照射30分鐘后的工作臺(tái)上（或超凈工作臺(tái)內(nèi)）。操作人員用新潔爾滅溶液洗手，然后按無(wú)菌操作要求開(kāi)始接種。先將菌種斜面和待接種的培養(yǎng)基斜面試管口上的棉花塞通過(guò)酒精燈火焰稍稍扭動(dòng)一下，以免接種時(shí)不易拔出棉塞。用左手握住菌種斜面和待接種的培養(yǎng)基斜面，將試管口靠近火焰旁，右手拿接種棒后端，在火焰上將接種環(huán)燒紅約30秒鐘，然后將全部金屬棒通過(guò)火焰往返3次，用右手無(wú)名指及小指同時(shí)將菌

24、種斜面和待接種的培養(yǎng)基斜面試管口的棉塞拔出，并將兩支試管口在火焰上通過(guò)一下，立即將接種環(huán)伸入菌種斜面管內(nèi)，先在近管壁的瓊脂培養(yǎng)基表面上靠一下，使稍冷卻，再移至菌苔上刮取少量菌苔，迅速將接種棒取出，并立即伸入到待接種的培養(yǎng)基斜面管內(nèi)，由下至上在培養(yǎng)基斜面上輕輕曲折移動(dòng)1次，取出接種棒，立即在火焰旁將原來(lái)的棉塞塞上，然后將接種棒上的殘余細(xì)菌在火焰上燒灼，燒灼時(shí)應(yīng)先將接種環(huán)離沾菌處的遠(yuǎn)端燒灼，使其傳熱至沾菌處，待菌苔已枯焦、炭化后，才能直接燒灼，切不可直接猛火燒灼沾菌處，以防細(xì)菌濺出。接種完畢后，將細(xì)菌管置37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2224小時(shí)（霉菌管一般置2627培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天）。取出放冷至室溫后，放入5

25、冰箱中保存。試驗(yàn)用菌液的制備和保存枯草芽孢桿菌懸液    取枯草芽胞桿菌CMCC(B)63501或CVCC717的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在3537培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65加熱30分鐘，備用。（取枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501試驗(yàn)用菌種斜面1支，按無(wú)菌操作要求加入滅菌水2ml，將菌苔洗下，搖勻，取出1ml接種于盛有30ml普通瓊脂培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，旋轉(zhuǎn)三角瓶使全部瓊脂培養(yǎng)基表面被菌液浸潤(rùn)，多余的菌液用吸管吸出棄入5%石炭酸消毒液中。將已接種的三角瓶置3537的培

26、養(yǎng)箱中培養(yǎng)710天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，制成懸液，在65水浴中加熱30分鐘，即得。置5冰箱中保存，可使用6個(gè)月。）短小芽孢桿菌懸液    取短小芽孢桿菌CMCC(B)63202或CVCC709的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備。金黃色葡萄球菌懸液    取金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003或CVCC1882的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。（取金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003試驗(yàn)

27、用菌種斜面1支，用接種棒取培養(yǎng)物接種至10ml培養(yǎng)基中，接種時(shí)在靠近培養(yǎng)基液面的試管壁上摩擦，使菌苔均勻混懸于液體培養(yǎng)基中，在3537培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1618小時(shí)，取出，應(yīng)成均勻的懸液，無(wú)菌膜及凝集沉淀，此菌液僅供當(dāng)日使用。）藤黃微球菌（藤黃八疊球菌）懸液    取藤黃微球菌CMCC(B)28001或CVCC1600德?tīng)I(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在2627培養(yǎng)24小時(shí)，或采用適當(dāng)方法制備的菌斜面，用培養(yǎng)基或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。（取藤黃八疊球菌CMCC(B)28001試驗(yàn)菌種斜面1支，加入2ml培養(yǎng)基，將菌苔洗下，搖勻，取

28、出1ml接種于盛有30ml普通瓊脂培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，旋轉(zhuǎn)三角瓶使全部瓊脂培養(yǎng)基表面被菌液浸潤(rùn)，多余的菌液用吸管吸出棄入5%石炭酸消毒液中，將已接種的三角瓶置2627培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用5ml培養(yǎng)基將菌苔洗下制成均勻的懸液。此懸液在5冰箱中保存可使用1個(gè)月。）大腸桿菌懸液    取大腸桿菌CMCC(B)44103或CVCC2801的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。雙碟的制備：取直徑約90mm、高1617mm的平底雙碟，用滅菌大口吸管分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤

29、布，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至4850（芽孢可至60），加入規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（能得到清晰的抑菌圈為度。二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在1822mm，三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在1518mm），充分搖勻，用滅菌大口吸管在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置水平臺(tái)上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm）4個(gè)（二劑量法）或6個(gè)（三劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。 抗生素微生物檢

30、定試驗(yàn)設(shè)計(jì)表抗生素類別試驗(yàn)菌培養(yǎng)基滅菌緩沖液PH值抗生素濃度范圍單位/ml培養(yǎng)條件編號(hào)PH值溫度/時(shí)間/小時(shí)鏈霉素枯草芽孢桿菌CMCCB（B）63 501或CVCC7177.88.07.80.61.635371416卡那霉素枯草芽孢桿菌CMCCB（B）63 501或CVCC7177.88.07.80.94.535371416吉他霉素枯草芽孢桿菌CMCCB（B）63 501或CVCC7178.08.27.820.040.035371618安普霉素枯草芽孢桿菌CMCCB（B）63 501或CVCC7177.88.07.85.020.035371618鹽霉素短小芽孢桿菌CMCC（B）63 202或C

31、VCC7096.56.66.010.040.035371416慶大霉素短小芽孢桿菌CMCC（B）63 202或CVCC7097.88.07.82.012.035371416紅霉素短小芽孢桿菌CMCC（B）63 202或CVCC7097.88.07.85.020.035371416新霉素金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003或CVCC18827.88.07.84.025.035371416青霉素金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003或CVCC18826.56.66.00.52.035371416四環(huán)素藤黃微球菌CMCC（B）28 001或CVCC16006.56.66.010.040.035

32、371618土霉素藤黃微球菌CMCC（B）28 001或CVCC16006.56.66.010.040.035371618金霉素藤黃微球菌CMCC（B）28 001或CVCC16006.56.66.04.025.035371618多西環(huán)素藤黃微球菌CMCC（B）28 001或CVCC16006.56.66.04.025.035371618桿菌肽藤黃微球菌CMCC（B）28 001或CVCC16006.56.66.00.512.035371618林可霉素藤黃微球菌CMCC（B）28 001或CVCC16007.88.07.82.012.035371618泰樂(lè)菌素藤黃微球菌CMCC（B）28 00

33、1或CVCC16006.56.66.02.510.035371618大觀菌素大腸桿菌CMCC（B）44 103或CVCC28017.88.07.050.0300.035371618     加0.3%葡萄糖。     此緩沖液含3%氯化鈉。     系指普魯卡因青霉素注射液。  補(bǔ)充：抗生素微生物檢定試驗(yàn)設(shè)計(jì)表抗生素類別試驗(yàn)菌培養(yǎng)基滅菌緩沖液PH值抗生素濃度范圍單位/ml培養(yǎng)條件編號(hào)PH值溫度/時(shí)間/小時(shí)丁胺卡那霉素枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 5017

34、.88.07.80.94.535371416巴龍霉素枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 5017.88.07.80.94.535371416卷曲霉素枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 5017.88.07.810.040.035371416碘芐青霉素枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 5016.56.66.05.010.035371416去甲萬(wàn)古霉素枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 5016.06.09.043.735371416頭孢噻肟鈉枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 501636.56.66.00.52.235371416頭孢羥氨芐金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 0036.56.66.05.020.0

35、35371416脫氧土霉素藤黃八疊球菌CMCC（B）28 0016.56.66.04.025.035371618氯霉素藤黃八疊球菌CMCC（B）28 0016.56.66.030.080.035371618克林霉素藤黃八疊球菌CMCC（B）28 0017.88.07.80.61.635371618粘霉素大腸桿菌CMCC（B）44 1037.27.46.0614234435371618附注抑菌圈大小預(yù)測(cè)試驗(yàn)方法：取雙碟6個(gè)，分為3組，每組2個(gè)，分別加入已融化的瓊脂培養(yǎng)基20ml，用陶瓦圓蓋覆蓋，待凝固后，作為底層培養(yǎng)基置37培養(yǎng)箱中保溫。另取已融化的瓊脂培養(yǎng)基分裝于3支大試管中，每支分裝20ml

36、。將大試管置恒溫水浴中放冷至表1中規(guī)定各試驗(yàn)菌的控制溫度，分別加入不同量的菌液，制成3種不同濃度的菌層培養(yǎng)基，搖勻，分別吸取3種濃度的菌層培養(yǎng)基各5ml，均勻地?cái)偛荚?組底層培養(yǎng)基上，每組雙碟用一種濃度的菌層培養(yǎng)基。然后按一劑量法、二劑量法或三劑量法用所欲測(cè)定抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定。測(cè)量各組雙碟抑菌圈的直徑，選擇抑菌圈直徑合適（一劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所產(chǎn)生的抑菌圈直徑應(yīng)為1518mm；二劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高劑量所產(chǎn)生的抑菌圈直徑應(yīng)為1824mm；三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中劑量所產(chǎn)生的抑菌圈直徑應(yīng)為1518mm）的菌層濃度進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。表1    

37、60;  菌 層 培 養(yǎng) 基 的 控 制 溫 度試驗(yàn)用菌種                                    菌層培養(yǎng)基溫度芽孢懸液60大腸桿菌菌液48金黃色葡萄球菌菌液4850藤黃八疊球菌菌液4850啤酒酵母菌懸液48 （2）     影響效價(jià)測(cè)定的因素1.試驗(yàn)菌種：當(dāng)試驗(yàn)菌種中含有對(duì)抗生素敏感度不同的兩種或兩種以上的菌株時(shí)，由于各菌株的最低抑菌濃度不同，在形成抑菌