VEGF受體KDR胞外Ⅴ～Ⅶ區(qū)的克隆、單抗制備及KDR在不同

1、VEGF受體KDR胞外區(qū)的克隆、單抗制備及KDR在不同來源腫瘤組織中的表達【摘要】目的利用制備的血管內(nèi)皮細胞增殖因子(VEGF)受體KDR抗體，通過免疫組化，檢測KDR在不同來源腫瘤組織中的表達，為探討VEGF及其受體對腫瘤生長及轉移的作用提供可能。方法采用RT-PCR方法，從人胎兒臍靜脈內(nèi)皮細胞克隆KDR胞外區(qū)基因片段，在大腸桿菌中表達，并用傳統(tǒng)的雜交瘤融合技術制備小鼠KDR單克隆抗體。通過組化及Western-blot鑒定KDR單抗的特異性，最后采用S-P免疫組化法，分別對不同來源的115例腫瘤組織及相應正常組織進行了KDR表達分析。結果不同來源的腫瘤組織中，KDR受體的表達率及強度存在差

2、異，移行上皮來源的膀胱癌100%表達KDR，表達強度最高；乳腺癌及腸道腺癌細胞表達KDR次之；肺鱗癌表達最弱。此外，腫瘤組織中不僅血管內(nèi)皮細胞表達KDR受體，且腫瘤細胞、血管平滑肌細胞及某些間質細胞也有KDR表達，而相應正常組織中KDR表達相對較弱。結論VEGF受體KDR不僅表達于腫瘤血管內(nèi)皮細胞，而且表達于腫瘤細胞，腫瘤細胞表達KDR的強度與組織來源有關?！局黝}詞】血管內(nèi)皮生長因子受體分子克隆抗體，單克隆 Cloning and monoclonal antibody preparation of VEGF receptor KDR extracellular domain and KDR

3、expression in carcinomas of different originsSONG Shumei, ZENG Li, WU Jian, et al. Beijing Institute for Cancer Research, Beijing Medical University, Beijing 100034【Abstract】ObjectiveTo examine the expression of VEGF receptor KDR in carcinomas of different origins and provide possibility of explorin

4、g its relation to tumor growth and metastasis. MethodsVEGF receptor KDR cDNA () fragment was cloned from human umbilical vein with RT-PCR and expressed in E.coli Jm109. The purified GST-KDR fusion protein was used to immunize Balb/c mice and monoclonal antibody against KDR was prepared. With this mo

5、noclonal antibody, tumor tissue and related normal tissue of different origins were examined immunohistochemically for KDR expression. ResultsThe frequency and intensity of KDR expression in different tumor tissues were obviously different. Transitional-cell cancer of urinary bladder was 100% KDR po

6、sitive and with highest intensity, while KDR expression in breast and intestinal adenocarcinoma was weaker and that in squamous-cell carcinoma of the lung was weakest. Moreover, KDR was also weakly expressed in other cells, such as smooth muscle cells and interstitial cells. ConclusionVEGF receptor

7、is expressed not only in the endothelial cells of tumor vasculature, but also in tumor cells. Tumor cell expression of KDR varies in intensity with tumors of different origins. The possible significance of VEGF receptor expression with regard to tumor cell proliferation and metastasis is discussed.【

8、Subject words】Vascular endothelium growth factor receptorsMolecular cloningAntibodies, monoclonal新生血管生成是實體瘤生長的必要條件1。在腫瘤生長過程中，腫瘤細胞能分泌許多血管內(nèi)皮細胞(EC)增殖因子，如bFGF、VEGF等，刺激腫瘤血管的形成。其中VEGF是刺激EC增殖的最重要而直接的因子，它在腫瘤新生血管形成中起重要作用。研究表明，許多腫瘤組織及腫瘤細胞株中均表達這一因子2，3。已知VEGF的兩種受體KDR和FLT-1均屬細胞表面的酪氨酸激酶受體，并特異表達于血管內(nèi)皮細胞4。然而近年來有人在巨噬

9、細胞及某些血液細胞中也檢測到KDR受體表達5。Boocock等6用RT-PCR在卵巢癌細胞株和卵巢癌組織中的血管內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞中，均檢測到FLT-1和KDR mRNA。這一結果提示，VEGF不僅作為旁分泌因子刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，同時還可能作為自分泌因子通過直接作用于腫瘤細胞自身的VEGF受體而促進腫瘤細胞生長。為進一步明確KDR在腫瘤細胞的表達及其與腫瘤組織來源的關系，了解VEGF及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制，我們自臍靜脈EC中克隆了KDR胞外區(qū)，并制備了相應單抗，運用KDR McAb研究了不同來源腫瘤組織中的KDR表達。材料與方法1.人臍靜脈EC分離及KDR胞外區(qū)的cDNA合成和

10、擴增：按楊小平法7分離人臍靜脈EC細胞，用RNA提取液Trisolv(美國Giotrx公司產(chǎn)品)按說明書提取EC中總RNA。根據(jù)KDR胞外區(qū)DNA序列合成5端引物：5-1：5-TAAGGATCCCA- CTCAAACGCTGAC-3及3端引物：3-1：5GGAGAA- TTCTCAACTGC ATGCCTGGCAG-3和3-2：5-TCCTGGGCACCTTCTA-3。用提取的3 g RNA及3-2引物，用逆轉錄酶M-ALV(Gibco公司)按說明行cDNA合成。取2.5 l逆轉錄產(chǎn)物為模板，以5-1和3-1為引物，通過PCR行KDR(-)DNA擴增，擴增條件為9445秒，481分鐘，721.

11、5分鐘，2個循環(huán)后將退火溫度從48升至60，其余條件不變，繼續(xù)擴增30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物行酶切(BamH I/EcoR I)及測序鑒定。2.KDR胞外區(qū)的重組及表達：PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I/EcoR I酶切、電泳分離純化后，將其克隆在谷胱苷肽-S-轉移酶(GST)表達載體pGEX2T(BamH I/EcoR I)中，并轉化大腸桿菌Jm109，分別用蛋白表達及質粒DNA酶譜分析進行克隆篩選。挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，按文獻方法8制備融合蛋白GST-KDR。3.KDR McAb制備及鑒定：用GST-KDR免疫Balb/c小鼠，用傳統(tǒng)雜交瘤技術進行細胞融合。雜交瘤上清經(jīng)ELISA雙篩(選擇抗GST-K

12、DR陽性而抗GST陰性者)和S-P組化篩選，經(jīng)4次亞克隆后建株，并用Western-blot進一步鑒定抗體的特異性。4.不同來源腫瘤組織中KDR的表達分析：收集25例肺鱗癌、30例乳腺癌、25例大腸腺癌及35例膀胱移行細胞癌腫瘤手術切除標本的存檔蠟塊。用上述制備的KDR抗體，通過S-P免疫組化法進行常規(guī)組化染色，鏡下觀察結果。結果1.KDR胞外區(qū)cDNA片段的擴增及酶切鑒定：以逆轉錄的KDR cDNA為模板，在3.75 mmol/L Mg+濃度下進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，見900 bp左右有一特異條帶，與理論推算值相符。用該特異片段構建的表達載體pGEX2T-KDR，經(jīng)BamH

13、 I/EcoR I酶切后也可放出900 bp左右的條帶(1)。M：DNA markers； 1：KDRV- RT-PCR產(chǎn)物；2：pGEX2T-KDR經(jīng)BamH I/EcoR I酶切消化后1KDRV-區(qū)RT-PCR產(chǎn)物及pGEX2T-KDR酶切鑒定2.KDR表達及純化：Jm109菌經(jīng)pGEX2T-KDR轉化，IPTG誘導后能穩(wěn)定表達GST-KDR融合蛋白，表達蛋白約占菌體蛋白的10%左右，相對分子量約60 000，與推算值相符。該蛋白以包含體形式存在，用堿變性法提取，并經(jīng)制備膠及電洗脫后得到純化的KDR重組蛋白(2)。M：分子量標準蛋白；1：未經(jīng)IPTG誘導的經(jīng)pGEX2T-KDR轉化的Jm1

14、09；2：經(jīng)IPTG誘導的轉化菌；3：經(jīng)純化后獲得的GST-KDR融合蛋白2GST-KDR在大腸桿菌Jm109中的表達及純化的GST-KDR融合蛋白3.KDR McAb制備及鑒定：經(jīng)常規(guī)融合及4次亞克隆化，并用ELISA和組化篩選后獲得12株KDR McAb，選取反應較強的SSW2制備腹水，并用蛋白A柱進行抗體純化。純化后的抗體經(jīng)ELISA及Wes- tern-blot鑒定，同KDR抗原及血管內(nèi)皮細胞均有較強的特異反應(3)。M：標準分子量蛋白；1：SSW2上清與KDR的反應；2：5株純化KDR McAb混合物與KDR的反應；3：小鼠IgG與KDR的反應3KDR McAb行Western bl

15、ot分析KDR蛋白4.不同來源腫瘤組織中KDR表達：以免疫組化法檢測115例不同來源的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)KDR在大多數(shù)腫瘤組織的腫瘤細胞及腫瘤血管內(nèi)皮細胞中呈強度不同的陽性反應。腫瘤細胞中的陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，主要位于細胞漿和細胞膜上，部分腫瘤細胞以胞膜為主。在不同來源的腫瘤組織，移行上皮來源的35例膀胱癌腫瘤細胞100%表達KDR，且陽性程度以中度及強陽性為主；腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞以弱陽性至中度陽性為主，亦有強陽性著染；間質中某些平滑肌細胞呈弱陽性反應，偶爾可見到部分淋巴細胞呈陽性反應。腺上皮來源的乳腺癌及腸癌組織中，腫瘤細胞的染色強度略弱于膀胱癌，KDR陽性百分率分別為92%及90%；血

16、管內(nèi)皮細胞多呈弱陽性，部分呈中度陽性著色；而正常乳腺及腸道組織呈陰性。肺癌表達KDR陽性百分率為77%，表達強度明顯弱于腺上皮及移行上皮來源的腫瘤。討論VEGF是一種分泌型糖蛋白，它與腫瘤的血管發(fā)生密切相關，它不僅直接刺激EC細胞的生長，而且可提高微血管的通透性，促進血漿的外滲。通常認為VEGF是特異性內(nèi)皮細胞生長因子，它通過作用于內(nèi)皮細胞上的特異受體FLT-1和KDR/flk-1發(fā)揮其生物學作用，而KDR/flk-1和FLT-1的表達局限于內(nèi)皮細胞。近年來，有人在非內(nèi)皮細胞中，如成骨細胞和巨噬細胞中也檢測到KDR表達5。Boocock等6用RT-PCR、原位雜交和免疫組化方法研究卵巢癌組織及

17、其細胞株中VEGF及其受體表達時發(fā)現(xiàn)，不僅腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞有KDR表達，且腫瘤細胞本身也有KDR表達。本研究結果表明，KDR不僅表達于腫瘤組織的血管EC細胞，而且廣泛表達于不同組織來源的腫瘤細胞，且腫瘤細胞表達KDR強度多高于EC細胞。我們還發(fā)現(xiàn)，除了腫瘤細胞、EC細胞表達KDR外，血管平滑肌細胞、肺癌中巨噬細胞、腸癌和膀胱癌中的淋巴細胞也有不同程度的表達。提示VEGF不僅是EC細胞增殖刺激因子，還可能通過表達于腫瘤細胞上的KDR受體而刺激腫瘤細胞的增殖或遷移，同時還可能通過間質組織細胞、M和淋巴細胞表達而促進間質的生成及局部免疫反應。本研究結果與Boocock等的報道基本一致，進一步提

18、示了VEGF通過自分泌或旁分泌途徑影響腫瘤細胞的生長及間質中血管的形成，同時也說明了腫瘤細胞的生長與腫瘤間質之間的依存關系。我們還發(fā)現(xiàn)，不同來源的腫瘤細胞，KDR表達存在明顯差異。來自移行上皮的35例膀胱癌細胞全部表達KDR，且其陽性程度高于肺鱗癌；腺上皮來源的乳腺癌和腸癌KDR也有較強的染色，而肺鱗癌染色較弱。KDR在不同來源腫瘤組織中表達差異的機理及其與腫瘤惡性程度的相關性以及VEGF結合腫瘤細胞KDR所誘發(fā)的一系列分子事件是否與內(nèi)皮細胞KDR相同等問題，均有待進一步研究。本課題受國家杰出青年科學基金資助(基金編號：39525021)作者單位：100034 北京市腫瘤防治研究所北京醫(yī)科大學

19、臨床腫瘤學院宋述梅(現(xiàn)工作單位：430070 武漢，湖北省腫瘤研究所)、吳健、孟麟、壽成超(聯(lián)系作者)；曾莉(北京醫(yī)科大學泌尿外科研究所)參考文獻1Folkman J. Tumor angiogenesis and tissue factor. Nature Medicine, 1996, 2：167-168.2Yashiji H, Gomez DE, Shibuya M, et al. Expression of VEGF, its receptor and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res, 1996,56：2013-2016.3Inoue K, Oreki Y, Suganuma T， et al. Vascular endothelial growth factor expression in primary esophageal squamous cell