獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)

1、獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)畜牧獸醫(yī)教研組 編龍巖學(xué)院二00六年十月編寫說明本實驗指導(dǎo)配合獸醫(yī)微生物學(xué)使用，目的是訓(xùn)練學(xué)生掌握獸醫(yī)微生物學(xué)最基本的實驗操作技能，了解微生物學(xué)的基本知識，加深理解課堂講授的獸醫(yī)微生物學(xué)理論知識，同時，通過實驗培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問題和解決問題的能力；實事求是，嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度；為以后課程的學(xué)習(xí)和將來的工作以及科學(xué)研究打下堅實的基礎(chǔ)。本實驗指導(dǎo)是在參考有關(guān)院校的獸醫(yī)微生物學(xué)實驗教材的基礎(chǔ)上，結(jié)合我們的實驗室條件以及儀器設(shè)備狀況，經(jīng)過多方取舍編寫而成，可供生物科學(xué)系師生參考。由于編者水平有限，加上時間倉促、經(jīng)驗不足，在許多方面肯定有不少缺點與錯誤，希望各位讀者批評指正。

2、在編寫過程中，得到龍巖學(xué)院生物系全體師生的大力支持，在此表示感謝。 編者2006.10目 錄實驗一 微生物染色法1實驗二 培養(yǎng)基的配制和滅菌6實驗三 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)8實驗四 雙向免疫擴(kuò)散試驗11實驗五 凝集反應(yīng)14實驗六 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）16實驗七 細(xì)菌各論（1）18實驗八 細(xì)菌各論（2）20實驗九 病毒的雞胚培養(yǎng)22實驗十 病毒的血凝及血凝抑制試驗25實驗一 微生物染色法一、目的要求1、學(xué)習(xí)掌握單染色的操作技術(shù)和無菌操作技術(shù)。2、了解革蘭氏染色機(jī)理，并掌握其操作技術(shù)。3、學(xué)習(xí)掌握細(xì)菌芽孢染色方法。二、實驗原理細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實驗中的一項基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，

3、在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進(jìn)行染色。利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。染色前

4、必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時盡量維持細(xì)胞原有的形。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰

5、性菌。革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所

6、以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。三、實驗器材1、菌種：蘇云金桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜面菌種。2、顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、蓋玻片、試管、水浴鍋。3、草酸銨結(jié)晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀綠溶液。四、方法步驟（一）單染色步驟：1、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。2、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。3、固

7、定：涂面朝上，通過微火2-3次。4、染色：待玻片泠卻后加結(jié)晶紫1-2滴于涂片上，覆蓋涂面染色1-2分鐘。5、水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無色為止（注：勿沖去菌體）。6、干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干。7、鏡檢：油鏡觀察并繪圖。（二）革蘭氏染色步驟1、涂片：取清潔玻片一塊，在玻片兩端1/4處下面用記號筆分別標(biāo)明S和E（見圖示），并滴一滴蒸餾水，分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌涂布在相應(yīng)的區(qū)域內(nèi)。2、干燥與固定：方法同（一）中2，3步驟。圖示3、染色：結(jié)晶紫染色1-2分鐘-水洗-碘液媒染1-2分鐘-水洗-酒精脫色15-20秒-水洗-番紅復(fù)染色2-3分鐘-水洗-干燥-鏡檢記錄。

8、（三）細(xì)菌的芽孢染色1、制備菌液：加1-2滴蒸餾水于試管中，從斜面挑取2-3環(huán)的菌苔于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。2、加染色液：加5%孔雀綠2-3滴于試管中用接種環(huán)攪拌，使其充分混合。3、加熱：將此試管浸于沸水浴中，加熱15-20分鐘。4、涂片：從試管底部挑菌液于潔凈的玻片上，涂成薄膜，晾干。5、固定：將涂片通過微火3次。6、脫色：水洗，直到流出的水中無綠色為止。7、復(fù)染：加番紅染色2-3分鐘后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸去余水，于酒精燈火焰上烘干。8、鏡檢：用油鏡觀察繪圖。五、結(jié)果與思考1、繪圖記錄觀察結(jié)果2、在制作涂片中，為什么要進(jìn)行固定這一步？3、革蘭氏染色中哪一步關(guān)鍵，

9、為什么？4、為什么芽孢要采用復(fù)染色法？（芽孢和菌體分別染成什么顏色） 實驗二 培養(yǎng)基的配制和滅菌一、實驗?zāi)康?.了解配制培養(yǎng)基的原理，并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2.了解加壓蒸汽滅菌的原理，并掌握其具體操作方法。二、實驗原理培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的

10、膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。三、實驗器材1.藥品及試劑：可溶性淀粉KNO3目K2HPO4·3H2OMgSO4·7H2OFeSO4·7H2O 1mol/LNaOH瓊脂2.儀器及其它試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(5.5-9.0)、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養(yǎng)皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠。四、方法步驟（一）培養(yǎng)基的制備與分裝1.稱量按培

11、養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取藥品?？扇苄缘矸巯扔蒙倭繜崴芑笤偌尤肫渌煞?，補(bǔ)足所需水分，混勻后加入瓊脂。2.熔化在沸水浴鍋中加熱熔化。4.過濾趁熱用多層紗布過濾（本實驗勿需過濾）5.分裝將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時，裝量不超過試管的1/4，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。6.加棉塞然后包扎一層牛皮紙。試管應(yīng)先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。（二）無菌水的制備7.用量筒量取45ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（三）器皿的準(zhǔn)備9.培養(yǎng)皿的包裝每6套一包，用舊報紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴(yán)）。10.吸管的包裝首先在吸管的上端塞上

12、一小段棉花，用長紙條包扎、打結(jié)。11.玻璃涂布棒的包裝方法同吸管的包裝。（四）培養(yǎng)基、無菌水、器皿的滅菌12.將培養(yǎng)基、無菌水放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，濕熱滅菌。13.滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面。14.器皿放入干熱滅菌箱內(nèi)，加熱滅菌。五、思考題1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無菌的？2.加壓蒸汽滅菌的原理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時就能達(dá)到所需滅菌溫度？為什么？3.干熱滅菌應(yīng)該注意哪些事項？4.管口、瓶口為什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？為什么實驗三 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 一、 實驗?zāi)康恼莆赵诟鞣N培養(yǎng)基上的接種方法并觀察生長現(xiàn)象二、 基本原理從

13、混雜的細(xì)菌群體中獲得只含有一種或某一株細(xì)菌的過程稱為細(xì)菌的分離與純培養(yǎng)。平板劃線法是最常用的方法之一，通過沾有樣本的接種環(huán)在平板上劃線，將樣本“稀釋”，培養(yǎng)后使之形成單個菌落，從而達(dá)到分離的目的。三、 實驗材料沙門氏菌、大腸桿菌、普通瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基、接種環(huán)、接種針、酒精燈四、 實驗步驟（一）平板劃線接種法（分離培養(yǎng)法）原理：通過在平板上劃線，將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板表面充分的分散開，使單個細(xì)菌能固定在一點上生長繁殖，形成單個菌落，以達(dá)到分離純種的目的。若需從平板上獲取純種，則挑取一個單個菌落作純培養(yǎng)。用途：分離出純種細(xì)菌，以利作純培養(yǎng)。操作方法（三區(qū)劃線法）：1、

14、右手拿接種環(huán)，燒灼冷卻后，取菌液一環(huán)。 2、左手抓握瓊脂平板（讓皿蓋留于桌上），在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中雜菌落入，右手將已沾菌的接種環(huán)在瓊脂表面密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個平板的1/5-1/6，此為第一區(qū)。劃線時接種環(huán)與瓊脂呈30-40度角輕輕接觸，利用腕力滑動，切忌劃破瓊脂。3、接種環(huán)上多余的細(xì)菌可燒灼（每劃完一個區(qū)域是否需要燒灼滅菌視標(biāo)本中含菌量多少而定），待冷后，在劃線末端重復(fù)2-3根線后，再劃下一區(qū)域（約占1/4面積），此為第二區(qū)。4、第二區(qū)劃完后可不燒灼接種環(huán)，用同樣方法劃第三區(qū)，劃滿整個平皿。 5、劃線完畢，將平板扣入皿蓋并作好標(biāo)記，置37溫箱孵育18

15、-24小時觀察瓊脂表面菌落分布情況，注意是否分離出單個菌落，并記錄菌落特征（如大小、形狀、透明度、色素等）。（二）液體培養(yǎng)基接種法用途：凡肉湯、蛋白胨水，各種單糖發(fā)酵均用此法接種。可以觀察細(xì)菌不同的生長性狀、生化特性以供鑒別之用。操作方法：右手執(zhí)筆式握住接種環(huán)，滅菌冷卻后取單個菌落。1、左手拇指、食指、中指托住液體培養(yǎng)基之下端，右手小指和無名指（或手掌）拔取試管塞，將管口移至火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼。2、將沾菌的接種環(huán)移入培養(yǎng)基管中，在液體偏少側(cè)接近液面的管壁上輕輕研磨，沾取少許液體與之調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中。3、管口通過火焰，塞好試管塞，將接種環(huán)滅菌后放下，經(jīng)37溫箱孵育18-24小時，取出觀察生

16、長情況。（三）半固體穿刺接種法用途：觀察細(xì)菌動力，保存菌種。方法：1、以無菌操作用接種針挑取單個菌落，立即垂直插入培養(yǎng)基中心至接近管底處循原路退回。2、管口通過火焰，塞上棉塞，接種針滅菌后放下。試管置37溫箱孵育18-24小時，取出后對光觀察穿刺線上細(xì)菌生長情況：細(xì)菌有無向周圍擴(kuò)散生長，穿刺線是否清晰等。（四）斜面培養(yǎng)基接種法 用途：常用于擴(kuò)大純種細(xì)菌及實驗室保存菌種。 操作方法：1、以無菌操作法用接種環(huán)挑取單個菌落，自斜面底向上劃一直線，然后再從底向上輕輕來回作蜿蜒劃線。2、管口通過火焰，塞上棉塞，接種環(huán)燒灼后方可放下。置37溫箱孵育18-24小時，取出觀察斜面上菌苔生長情況。五、結(jié)果與思考

17、題1、結(jié)果描述各接種方法細(xì)菌的生長情況2、思考題如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)？實驗四 雙向免疫擴(kuò)散試驗一、實驗?zāi)康?并熟練掌握免疫擴(kuò)散法的操作步驟掌握其在抗血清效價的測定和特異性抗體的分析中的應(yīng)用。二、實驗原理在一定條件下，抗原能與相應(yīng)的抗體相互作用，發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)。免疫擴(kuò)散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴(kuò)散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴(kuò)散而形成肉眼可見的帶狀或線狀沉淀帶?？乖贵w復(fù)合物的沉淀帶是一種特異性的半滲透性屏障，它可以阻止免疫學(xué)性質(zhì)與其相似的抗原抗體分子通過，而允許那些性質(zhì)不相似的分子繼續(xù)擴(kuò)散，這樣由不同抗原或不同抗體所形

18、成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統(tǒng)。利用瓊脂糖凝膠作為擴(kuò)散介質(zhì)是因為一定濃度的瓊脂糖凝膠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質(zhì)（分子量自十幾萬到幾百萬以上）自由通過。因為大多數(shù)抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴(kuò)散。而且瓊脂糖凝膠又具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優(yōu)點，因此是免疫沉淀檢測技術(shù)中最理想的擴(kuò)散介質(zhì)。雙向免疫擴(kuò)散法測定時將加熱溶化的瓊脂或瓊脂糖澆至玻片上，等瓊脂凝固后，打多個小孔，將抗原和抗體分別加入小孔內(nèi)，使抗原和抗體在瓊脂板上相互擴(kuò)散。當(dāng)二個擴(kuò)散圈相遇，如抗原和抗體呈特異性的結(jié)合且比例適

19、當(dāng)時，將會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀，該沉淀可在瓊脂中呈現(xiàn)一條不透明的白色沉淀線。如果抗原與抗體無關(guān)，就不會出現(xiàn)沉淀線，因此可以通過該試驗，用特異性抗體鑒定抗原，或反之用已知抗原鑒定抗體。另外沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原，抗體的特異性和濃度，而且與其分子的大小及擴(kuò)散速度有關(guān)，當(dāng)抗原體存在多種成分時，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應(yīng)用范圍較廣。三、實驗器材1材料和試劑（1）PH8.6，0.1M巴比妥巴比妥鈉緩沖液（2）1%預(yù)復(fù)瓊脂（或瓊脂糖）（3）1%瓊脂糖凝膠。（4）豬瘟標(biāo)準(zhǔn)抗原及被檢免疫血清。2設(shè)備和器材玻璃板、模

20、具，打孔器和挑針、滴管、有蓋搪瓷盒（內(nèi)鋪有濕潤的濾紙）、溫箱（25）、三角燒杯、玻璃攪拌、微量加樣器、其他常用器材。四、實驗步驟1預(yù)復(fù)瓊脂玻板的制備將溶化的1%預(yù)復(fù)瓊脂用滴管加玻板上，使之能將表面覆蓋即可，放于溫箱內(nèi)干燥（或自然干燥），即可用以制備凝膠板。2凝膠板的制備溶化瓊脂糖，在水平桌上將溶化的瓊脂糖倒在預(yù)復(fù)瓊脂玻板上，制成厚度約34mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔（注意不宜在室溫下放置過久，盡量縮短操作時間，以免干燥）。梅花型：3免疫擴(kuò)散及結(jié)果觀察將抗原加入中心孔，倍比稀釋的免疫血清加入周圍孔，留1孔加雙蒸水，以作空白對照（注意：加樣至孔滿為止，不可外溢）。待孔內(nèi)液體滲入凝

21、膠后即可放于溫盒中（如需要可重復(fù)加樣，加樣間隔時間應(yīng)掌握在第一次加樣后孔內(nèi)液體尚未完全擴(kuò)散完的情況下即加入，以免孔周圍形成不透明的白色圈）。濕盒于25中，一般保溫2448h，觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。免疫血精的滴度以一定抗原濃度下出現(xiàn)白色沉淀線的最高稀釋度來表示。如不知抗原濃度是否與免疫血清相當(dāng)時，抗原也可倍比稀釋，多做幾個梅花孔以作比較。五、結(jié)果與思考題1結(jié)果寫出所測免疫血清效價2思考題本實驗操作應(yīng)注意哪些事項？實驗五 凝集反應(yīng)一、實驗?zāi)康?掌握凝集反應(yīng)的概念、原理及操作方法和注意事項二、實驗原理顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)（通常是0.85%NaCl）存在的

22、條件下出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)的方法有兩種：直接法；間接法。顆粒性抗原與抗體直接結(jié)合，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱為直接凝集反應(yīng)。如玻片凝集反應(yīng)和試管凝集反應(yīng)。將可溶性抗原預(yù)先吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)的抗體結(jié)合，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。三、實驗器材玻璃板、微量移液器、蠟筆、布氏陽性血清、陰性血清、生理鹽水、布氏平板凝集抗原、火柴、被檢血清、96孔微量反應(yīng)板、豬瘟間接血凝試驗抗原、被檢血清、稀釋液 。四、實驗步驟（一）布氏平板凝集1、蠟筆打格子，每個格子為2cm*2cm，橫為6個。 2、用吸管按0.08ul、0.04ul、0.02ul、0.01ul量加入前4格被檢

23、血清，第5格加入陽性血清、第6格加入陰性血清。 3、各格中加0.03ul布氏平板凝集抗原。 4、用火柴棒將抗原和相應(yīng)液體血清攪勻。 5、35分鐘觀察凝集現(xiàn)象。牛、馬在0.02ul格中出現(xiàn)凝集（相當(dāng)效價是1：100），豬、羊在0.04ul格中出現(xiàn)凝集（相當(dāng)效價是1：50）為陽性。說明該家畜已感染布氏桿菌病。（二）豬瘟間接血凝試驗1、在96孔微量反應(yīng)板一排18孔內(nèi)加50ul稀釋液，2、第1孔加50ul被檢血清，對比稀釋為1：2，混勻，在此孔吸50ul到第2孔，混勻為1：4，以此類推，到7孔，并把7孔混勻后，棄去50ul，第8孔為陰性對照。3、用移液器各吸25ul豬瘟間接診斷抗原，加入1-8孔內(nèi)，應(yīng)

24、從后向前加抗原。4、把微量反應(yīng)板放微量振蕩器上搖2分鐘，后置37度濕盒內(nèi)作用1、52小時。5、觀察血凝結(jié)果，不凝集的孔，紅細(xì)胞沉入孔底尖部，凝集時，紅細(xì)胞鋪滿孔底。（豬瘟抗體合格是，1：16以上。）五、結(jié)果與思考題1、結(jié)果（1）描述玻板凝集試驗各血清量中凝集現(xiàn)象及結(jié)果（2）列出所檢測的豬血清，布氏抗體和豬瘟抗體效價2、思考題（1）、何為前滯、后滯現(xiàn)象？ （2）、血清學(xué)反應(yīng)為何要設(shè)陽性、陰性對照？（3）、試述本試驗操作的注意事項。實驗六 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）一、實驗?zāi)康?、掌握ELISA試驗的原理、方法和優(yōu)點2、了解ELISA在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用二、實驗原理ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）

25、的基本原理是通過化學(xué)和免疫學(xué)的方法，將酶標(biāo)記在抗原或抗體上（酶結(jié)合物），使其保持免疫學(xué)、生物學(xué)活性。當(dāng)酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)時，就可形成即有免疫學(xué)活性又有酶活性的“抗原-抗體-酶”的復(fù)合物，然后加入相應(yīng)的酶底物，借助酶的催化作用，無色的底物發(fā)生水解，氧化或還原反應(yīng)等，形成有色的或電子致密的不溶性產(chǎn)物。這種產(chǎn)物用肉眼、分光光度計、普通顯微鏡或電子顯微鏡都可以觀察，從而判定樣品中抗原或抗體的存在。由于顏色反應(yīng)的深淺與樣品中相應(yīng)抗原或抗體含量成正比，所以對樣品的測定即可以定性又可以定量。三、試驗材料豬瘟抗體檢測ELISA試劑盒、被檢血清（耳靜脈或前腔靜脈無菌采血3-5毫升，分離血清，冷凍

26、保存（但應(yīng)避免反復(fù)凍融），備用）、移液器、酶標(biāo)儀四、實驗步驟1、用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原各作100倍稀釋，以100微升分別加入做好標(biāo)記的酶聯(lián)板中，置濕盒于4過夜。2、棄去孔內(nèi)液體。用洗滌液沖洗板3次，每次間隔3-5min，拍干。3、用稀釋液將待檢血清作400倍稀釋，每孔加100微升。同時，將豬瘟陽性、陰性血清以100倍稀釋作對照，37培育1.5-2小時。4、重復(fù)第2步。5、用稀釋液將兔抗豬IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物作100倍稀釋，每孔加入100微升，37培育1.5-2小時。6、重復(fù)第2步。7、每孔加入底物溶液（每塊板所需的底物溶液按鄰苯二胺5毫升+底物緩沖

27、液5毫升+30%過氧化氫18.75微升配制）100微升，室溫下觀察顯色反應(yīng)（當(dāng)陰性對照孔略微顯色，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔作空白調(diào)零）。8、每孔加入終止液50微升，于酶聯(lián)讀數(shù)儀上測定490納米（nm）波長的光密度（OD）。判定標(biāo)準(zhǔn)在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上：OD0.2為豬瘟弱毒抗體陽性；OD<0.2為豬瘟弱毒抗體陰性。在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上：OD0.5為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽性；OD<0.5為豬瘟強(qiáng)毒抗體陰性。五、結(jié)果與思考題1、結(jié)果列出各血清OD值，計算結(jié)果，判定被檢血清豬瘟抗體情況。2、思考題（1）ELISA法為什么說是一種較敏感的血清學(xué)方法？（2）ELISA法操作時應(yīng)注意哪些事項？如何判定結(jié)果？

28、實驗七 細(xì)菌各論（1）一、實驗?zāi)康?.了解幾種常見病原性球菌的主要生物學(xué)性狀.2.掌握致病性葡萄球菌的鑒定方法.二、實驗原理病原性球菌主要指葡萄球菌，鏈球菌，肺炎球菌，腦膜炎球菌，淋球菌等，這些細(xì)菌經(jīng)常引起人類的化膿性疾病，故又稱化膿性球菌，這些細(xì)菌在革蘭氏染色，形態(tài)及培養(yǎng)等方面各有特性，熟悉掌握這些特點，在臨床進(jìn)行微生物學(xué)檢查時，即可做出正確的初步判斷，以便做進(jìn)一步的有關(guān)試驗，如致病性，耐藥性，分型(血清型，噬菌體型)等。致病性葡萄球菌的鑒定，方法很多，。血漿凝固酶試驗多數(shù)致病性金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使含有構(gòu)櫞酸鈉或盱素抗凝劑的人或兔等動物血漿發(fā)生凝固，凝固血漿沉積于菌體表面，阻

29、礙細(xì)胞吞噬，即使被吞噬，不易被殺死。葡萄球菌感染灶局限化，也與此酶有關(guān)。在臨床微生物學(xué)檢查中，血漿凝固酶試驗是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。血漿凝固酶試驗有玻片法和試管法兩種。三、實驗材料金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌(白葡)、化膿性鏈球菌24小時血瓊脂平板培物、生理鹽水，接種環(huán)，酒精燈，革蘭氏染液，載玻片，蠟筆，兔血漿(14稀釋)，毛細(xì)吸管，37水浴箱。四、實驗步驟1.觀察化膿性球菌在血瓊脂平板上的菌落大小，表面，邊緣，透明度，溶血性及顏色，觀察記錄結(jié)果。2.形態(tài)染色的檢查(1)取一潔凈載玻片，在背面分成4格標(biāo)號。(2)每一格取23接種環(huán)生理鹽水后，分別取金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌(白葡)、

30、化膿性鏈球菌，制成的細(xì)菌涂片，注意每取一種菌前，接種環(huán)要經(jīng)火焰滅菌。(3)革蘭氏染色后，油鏡觀察各菌的染色特性及形態(tài)排列，記錄結(jié)果。3、血漿凝固酶試驗(1)取潔凈玻片一張，于兩端各加兔血漿一滴。(2)用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌苔一環(huán)，在玻片一端兔血漿中研磨混勻，接種環(huán)滅菌后再取白色葡萄球菌苔一環(huán)，在另一端兔血漿中研磨均勻。(3)觀察兔血漿有無凝集現(xiàn)象。五、結(jié)果與思考題1、結(jié)果（1）觀察化膿性球菌在血瓊脂平板上的菌落大小，表面，邊緣，透明度，溶血性及顏色，觀察記錄結(jié)果。（2）油鏡觀察各菌的染色特性及形態(tài)排列，記錄結(jié)果。（3）血漿凝固酶試驗結(jié)果2、思考題（1）葡萄球菌與鏈球菌的血平板培養(yǎng)特點有何相似

31、之處常需做哪些實驗檢查來區(qū)別？（2）鑒別葡萄球菌有無致病性的方法有哪些？實驗八 細(xì)菌各論（2）一、實驗?zāi)康?1掌握腸道條件致病菌與腸道致病菌的菌落特點。2掌握腸道桿菌的主要生化反應(yīng)。3初步了解腸道桿菌的分離鑒定方法。 二 、實驗原理 腸道菌科的細(xì)菌為革蘭氏陰性桿菌，大多數(shù)有鞭毛，能運動。少數(shù)無鞭毛不能運 動，不產(chǎn)生芽胞，需氧或兼性厭氧，在普通培養(yǎng)基上，一般都生長良好，均能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸或產(chǎn)氣，觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性，還原硝酸鹽（歐文氏菌屬例外）。這類細(xì)菌是人類和動物腸道中的細(xì)菌，有的引起腹瀉、腸炎、腸熱癥和痢疾等。有的為條件致病菌，有時也可引起身體各個部位的感染。鑒別腸道桿菌一般用生化反

32、應(yīng)作初步鑒定，然后再根據(jù)各種菌的抗原特異性作進(jìn)一步的鑒定（包括血清學(xué)試驗和特異性噬菌體的溶菌試驗）。腸道桿菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上能生長，大多形成中等大小，表面光滑形態(tài)相似的菌落，因而也不能做為鑒別的依據(jù)。但它們生化反應(yīng)活潑，對糖和蛋白質(zhì)可產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，可借生化反應(yīng)鑒別各種腸道菌，特別是腸道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多數(shù)分解乳糖，臨床上常用此特性分離腸道致病菌。三、實驗材料 （大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌）的1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物、中國藍(lán)培養(yǎng)基，SS瓊脂的1824小時培養(yǎng)物、五管糖及雙糖鐵培養(yǎng)基的1824小時培養(yǎng)物。生理鹽水、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、革蘭氏染色液、蠟筆等。

33、四、實驗步驟1取載玻片，用蠟筆分成4格，于每格放23接種環(huán)生理鹽水。2用接種環(huán)分別取大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌制成涂片，注意無菌操作。3革蘭氏染色后鏡檢，記錄結(jié)果。4. 觀察各種細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長特點及生化反應(yīng)情況，分別將結(jié)果填入實驗報告。五、結(jié)果與思考題1、結(jié)果（1）觀察各種細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長特點及革蘭氏染色結(jié)果（2）各菌在不同培養(yǎng)基上的生化反應(yīng)情況2、思考題（1）觀察各種細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長特點有何不同？（2）如何鑒別腸道菌屬？主要有哪些方法？實驗九 病毒的雞胚培養(yǎng)一、 實驗?zāi)康?、了解動物病毒雞胚培養(yǎng)的意義和用途 2、掌握雞胚尿囊腔接種的方法與尿囊液收獲的方法 二、 實

34、驗原理雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養(yǎng)方法，此方法可用以進(jìn)行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的制備等。雞胚培養(yǎng)的技術(shù)比組織培養(yǎng)容易成功，也比接種動物的動物來源容易，無飼養(yǎng)管理及隔離等的特殊要求，且雞胚一般無病毒隱性感染，同時它的敏感范圍很廣，多種病毒均能適應(yīng)，因此，是常用的一種培養(yǎng)動物病毒的方法。各種病毒接種雞胚均有其最適宜的途徑，故應(yīng)注意選擇。本實驗用雞新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接種雞胚。雞新城疫病毒適宜接種在尿囊腔和羊膜腔內(nèi)，生長后，雞胚全身皮膚出現(xiàn)出血點，以腦后最顯著。三、 實驗器材新城疫病毒液；白殼受精卵（

35、自產(chǎn)出后不超過10天，以5天以內(nèi)的卵為最好）；孵卵器，檢卵燈，齒鉆，磨殼器，鋼針，蛋座木架，注射器，25%碘酒，70%酒精，鑷子，剪刀，封蠟（固體石蠟加 1/4凡士林，溶化），滅菌培養(yǎng)皿，滅菌蓋玻片等。四、 實驗步驟1 準(zhǔn)備蛋胚孵育前的雞卵先用清水以布洗凈，再用干布擦干，放入孵卵器內(nèi)進(jìn)行孵育（37，相對濕度是4560%），孵育三日后，雞卵每日翻動12次。孵至第4日，用檢卵燈觀察雞胚發(fā)育情況，未受精卵，只見模糊的卵黃黑影，不見雞胚的形跡，這種雞卵應(yīng)淘汰?；钆呖煽吹角逦难芎碗u胚的暗影，比較大一些的可以看見胚動，隨后每日觀察一次，將胚動呆滯或沒有運動的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或?qū)⑺赖碾u胚，

36、要隨時加以淘汰。生長良好的蛋胚一直孵育到接種前，具體胚齡視所擬培養(yǎng)的病毒種類和接種途徑而定。2接種用孵育1012天的蛋胚，因這時尿囊液積存得最多。(a)將蛋胚在檢卵燈上照視，用鉛筆畫出氣室與胚胎位置，并在絨毛尿囊膜血管較少的地方作記號。(b)將蛋胚豎放在蛋座木架上，鈍端向上。用碘酒消毒氣室蛋殼，并用鋼針在記號處鉆一小孔。(c)用帶18mm長針頭的1ml注射器吸取雞新城疫病毒液，針頭刺入孔內(nèi)，經(jīng)絨毛尿囊膜入尿囊腔，注入01ml病毒液。(d)用石蠟封孔后于37孵卵器孵育72小時。3收獲(a)將蛋胚放在冰箱內(nèi)冷凍半日或一夜，使血管收縮，以便得到無胎血的純尿囊液。(b)用碘酒消毒氣室處的卵殼，并用滅菌剪刀除去氣室的卵殼。切開殼膜及其下面的絨毛尿囊膜，翻開到卵殼邊上。(c)將雞卵傾向一側(cè)，用滅菌吸管吸出尿囊液。一個蛋胚約可收獲6ml左右尿囊液。若操作時損傷了血管，則病毒會吸附在紅細(xì)胞上，尿囊液成為無用。收獲的尿囊液經(jīng)無菌試驗后可在4以下的溫度中保存。(d)觀察雞胚，看有無典型的癥狀。五、 結(jié)果與思考題1