2017年主管檢驗(yàn)技師考試臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)講義第十七章流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用

1、第十七章流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry , FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理 化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。流式細(xì)胞儀的發(fā)展綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、顯微熒光 光度測(cè)定技術(shù)、流體噴射技術(shù)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等多門學(xué)科的知識(shí)。第一節(jié)概述流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、光學(xué)與信號(hào)轉(zhuǎn)換測(cè)試系統(tǒng)和信號(hào)處理及放大的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)三大基本結(jié)構(gòu)組成， 可對(duì)細(xì)胞懸液中的單個(gè)細(xì)胞或特定細(xì)胞或其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行多參數(shù)快速分析，帶分選系統(tǒng)的流式細(xì)胞儀還可 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求分選出具相同特征的同類型細(xì)胞，用于培養(yǎng)或進(jìn)一步研究。流式細(xì)胞術(shù)所具有的分析和分 選功能主要

2、涉及光學(xué)原理、光電轉(zhuǎn)換原理和測(cè)試原理三部分。一、工作原理采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào) 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析的精確性。散射光的測(cè)定散射光信號(hào)的產(chǎn)生是細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，散射光的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、光學(xué)同性、胞內(nèi)顆粒折射有關(guān)，與接收散射光的方向也有關(guān)。流式細(xì)胞儀中涉 及的散射光信號(hào)分為前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）。（一）前向散射光 激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)

3、軸較小的角度（0.5。10 °）向前方散射訊號(hào)。在激光束正前方的檢測(cè)器為前向散射光檢測(cè)器，其收集的散射光信號(hào)又稱為小角散射，對(duì)同一個(gè)細(xì)胞群體，F(xiàn)S信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的體積成正比，因此可以說(shuō)FS是用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子物體的表面屬性。（二）側(cè)向散射光 激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以 90°角散射的訊號(hào)。與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向光檢測(cè)器，也稱為90°散射光檢測(cè)器。其收集的散射光信號(hào)主要由細(xì)胞的致密性及粒度折射產(chǎn)生，SS信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞或其他顆粒形狀及粒度成正比。SS用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，可獲得有關(guān)細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的參數(shù)。二、熒光測(cè)量熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特

4、異性熒光染料受激光激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不相 同。每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)后又產(chǎn)生特定波長(zhǎng)熒光。通過(guò)一些波長(zhǎng)選擇通透性濾光片， 可將不同波長(zhǎng)的散射光、熒光信號(hào)區(qū)分開。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料可以利用流式細(xì)胞儀同時(shí)測(cè) 定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。三、細(xì)胞分選1. 分選速度：至少達(dá) 5000個(gè)/秒左右，以保證被分選細(xì)胞的生物學(xué)活性不受影響。2. 分選得率：是指從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后獲得目的細(xì)胞的實(shí)際得率。 該得率與分選的速度密切相關(guān)，當(dāng)分選速度過(guò)高，會(huì)使部分目的細(xì)胞漏檢，使得率下降；分選速度降低， 目的細(xì)胞信號(hào)被檢時(shí)間增加，得率增加。分

5、選純度：與儀器的精密度直接相關(guān)，同時(shí)與被分選細(xì)胞與細(xì)胞懸液中其他細(xì)胞有無(wú)相互重疊的生物 學(xué)特性密切相關(guān)。分選收獲率：是指設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞與實(shí)際收獲的分選細(xì)胞之間的比率。收獲率的高低同樣 與被分選細(xì)胞和不選細(xì)胞間的生物學(xué)特性是否重疊有一定關(guān)系。收獲率與純度之問(wèn)有相對(duì)應(yīng)關(guān)系。當(dāng)被要 求分選的細(xì)胞純度高，收獲率相對(duì)低，當(dāng)被要求分選的細(xì)胞收獲率高，其純度就相對(duì)降低。第1頁(yè)共4頁(yè)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析1、參數(shù)（一）前向散射光（FS）:反映顆粒的大小。（二）側(cè)向散射光（SS :反映顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、表面的光滑程度。（三）熒光（FL）:反映顆粒被染上熒光部分?jǐn)?shù)量的多少。二、數(shù)據(jù)顯示方式（一）單參

6、數(shù)直方圖：一維資料中最多使用的圖形，由一維參數(shù)（熒光或散射光）與顆粒計(jì)數(shù)構(gòu)成， 反映同樣熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少，可用于定性、定量資料的分析。（二）雙參數(shù)散點(diǎn)圖：雙參數(shù)散點(diǎn)圖是一種細(xì)胞數(shù)與雙測(cè)量參數(shù)的圖形，縱坐標(biāo)與橫坐標(biāo)分別代表被 測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，就可確定細(xì)胞在雙參數(shù)散點(diǎn)圖上的表達(dá)位置。（三）三參數(shù)散點(diǎn)圖：流式細(xì)胞儀的軟件技術(shù)發(fā)展到今天，不少商品化的軟件均提供三參數(shù)直方圖功 能，這意味著這一類散點(diǎn)圖的三維坐標(biāo)均為參數(shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。這一立體圖以點(diǎn)圖為顯示 方式，同樣可以做全方位旋轉(zhuǎn)以便仔細(xì)觀察。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析：標(biāo)記了多色熒光的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀

7、上被激光激發(fā)后，所得到的熒 光信號(hào)和散射光信號(hào)可以根據(jù)需要進(jìn)行組合分析以獲得所需的信息，這就是流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析。第三節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求一、免疫檢測(cè)樣品制備（一）新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備：最常用的方法有機(jī)械法、酶處理法、化學(xué)試劑處理法和表面 活性劑處理法等方法。（二）單細(xì)胞懸液的保存：最常用的處理方法有三種：深低溫保存法，乙醇或甲醇保存法，甲醛或多 聚甲醛保存法。二、免疫分析中常用的熒光染料與標(biāo)記染色在流式細(xì)胞免疫分析技術(shù)中，被測(cè)定的信號(hào)參數(shù)主要包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)兩種，熒光信號(hào)來(lái)自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后，在激光束激發(fā)下產(chǎn)生的發(fā)射光。因此，熒

8、光染 料的選擇和標(biāo)記染色都是保證熒光信號(hào)產(chǎn)生非常關(guān)鍵的技術(shù)指標(biāo)。（一）免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光染料在流式免疫技術(shù)中，最常用的染料有異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白類（phycoerythrin , PE）、羅丹明。1. 異硫氰酸熒光素（FITC）:可產(chǎn)生亮綠色熒光。FITC是免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光探針。2. 德州紅：與生物素偶聯(lián)的抗體有很強(qiáng)的親和力，產(chǎn)生紅色熒光。3. 藻膽蛋白類：用于熒光分析和標(biāo)記各類抗體的最常用熒光染料，主要包括藻紅蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、別藻青蛋白（APC三類。多發(fā)生橙色至紅色熒光。（二 ）免疫熒光標(biāo)記通常應(yīng)用的標(biāo)記染色為直接免疫熒光染色和間接免疫熒光染色兩

9、種方法。（三）細(xì)胞自發(fā)熒光三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用CBA技術(shù)屬于其中的重要代“液相芯片”技術(shù)是膠乳顆粒在流式細(xì)胞分析中的應(yīng)用，流式微球陣列（ 表。第四節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析（一）T淋巴細(xì)胞及其亞群的分析外周成熟的T細(xì)胞特有的標(biāo)志TCR和CD3是重要的表面抗原，再按 CD分子表達(dá)不同將T細(xì)胞分為CD4 和CD8兩大亞群，又稱為輔助性 T細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）。采用三色標(biāo)記單克隆熒光抗體 ， 用FCMI檢測(cè)，可對(duì)T細(xì)胞及亞群作出精確分類。（二）B淋巴細(xì)胞及其亞群的分析外周血中成熟的B細(xì)胞特有的重要標(biāo)志為 BCR即膜表面免疫球蛋白（Smlg），屬

10、于B細(xì)胞特有或涉及 B細(xì)胞的CD分子有29種。成熟的B細(xì)胞主要表達(dá) CD19 CD20 CD21 CD22分子，同時(shí)檢測(cè) CD5分子，可 進(jìn)一步將外周成熟的休止 B細(xì)胞分為B細(xì)胞和E2細(xì)胞。（三）NK細(xì)胞分析正常人外周血中成熟的 NK細(xì)胞約10滋右，目前臨床上常用三色熒光抗體標(biāo)記將CD3CD16CD56淋巴細(xì)胞確定為NK細(xì)胞。二、淋巴細(xì)胞功能分析需采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定或體外培養(yǎng)后細(xì)胞的標(biāo)記染色進(jìn)行淋巴細(xì)胞檢測(cè)，如：1. 細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)2. 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型FCM在淋巴瘤及血液病的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療和預(yù)后判斷方面都具有重要的價(jià)值。四、腫瘤耐藥相

11、關(guān)蛋白分析五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征（ AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染人體后，選擇性侵入 人類T淋巴細(xì)胞亞群中的 CD4T輔助細(xì)胞，使 Th細(xì)胞群體受到破壞，T細(xì)胞亞群比例失衡，T淋巴細(xì)胞功 能降低，進(jìn)一步導(dǎo)致全身免疫功能受損，全身免疫狀態(tài)下降。AIDS患者的一個(gè)特征性免疫診斷指標(biāo)表現(xiàn)為：T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少，T細(xì)胞亞群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc v 1.0 , Th細(xì)胞數(shù)量顯著下F降甚至測(cè)不出，而Tc細(xì)胞數(shù)量可正?；蛟黾?，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則處于正常范圍。HIV攜帶者，病毒未復(fù)制時(shí)，其Th細(xì)胞下降不明顯；HIV陽(yáng)性

12、而無(wú)癥狀的患者，Tc對(duì)Tc激活劑不反應(yīng)者，其體內(nèi)CD4 Th細(xì)胞水平下降迅速，條件致病微生物的感染率也同時(shí)增加，對(duì)Tc激活劑反應(yīng)敏感者，可維持CD4Th細(xì)胞水平降低較慢或不降低，減少發(fā)生 AIDS的幾率。當(dāng)發(fā)展為 AIDS時(shí)，Th細(xì)胞水平明顯下 降，如Th1細(xì)胞v Th2細(xì)胞時(shí)，HIV在細(xì)胞間的傳播和感染更敏感，更易發(fā)生AIDS。六、自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析在某些自身免疫性疾病中，HLA抗原的檢出率較正常人群中所檢出者為高。最典型的疾病是 強(qiáng)直性脊柱炎，其外周的HLA-B27的表達(dá)及表達(dá)程度與疾病的發(fā)生有很高的相關(guān)性。七、移植免疫中的應(yīng)用移植免疫中的 FCM應(yīng)用主要包括流式細(xì)胞術(shù)的交叉配型（FCXM和群體反應(yīng)性抗體（PRA檢測(cè)。 下列英文縮寫代表輔助性 T細(xì)胞的是A. TsB. ThC. TcD. TdE. Tcs正確答案B答案解析輔助性 T細(xì)胞的英文縮寫是 Th。與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的HLA是A. B7B. B27C. B48D. B51E. B52正確答案B答案解析與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的HL