肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表達

1、人心肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表達李子穎作者單位： 原子高科股份有限公司（北京 102413）；2中國食品藥品檢定研究院（北京 100050）；3 中國原子能科學研究院通訊作者： 李子穎，E-mail：ciaelee，賈娟娟2，劉一兵1，韓世泉3【摘要】 目的 構(gòu)建人肌酸激酶MB同工酶的原核表達系統(tǒng)，純化重組酶蛋白并檢測其活性。方法 從購買的含CKM、CKB基因片段的質(zhì)粒中擴增人肌酸激酶M、B亞基基因，構(gòu)建pGEX-4T-1-CKMB Ecoli BL21 (DE3)GST原核表達系統(tǒng)。以異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組蛋白表達。利用重組蛋白的GST標簽親和層析純化。結(jié)果

2、 重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定與預期相符，誘導表達后細菌裂解液純化后SDSPAGE在分子量110,000（CKMB）處顯示單一蛋白條帶，采用酶聯(lián)免疫分析的方法進行免疫活性實驗，所得的蛋白和CKB、CKM抗體都有免疫結(jié)合。結(jié)論 成功表達并純化了人肌酸激酶MB同工酶。 【關(guān)鍵詞】：人肌酸激酶MB同工酶；原核細胞；基因表達Cloning and prokaryotic expression of humn creatine kinase-MB isoenzyme(CK-MB)Li Zi-ying*, Jia Juan-juan, Liu Yi-bing, Han Shi-quan（*Atom H

3、ighTech Co., Ltd.， Beijing，102413 ，China）【Abstract】 Objective To clone the whole gene of human creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB) and express in prokaryotic cells, then purify recombinant CK-MB and determine its antigen-binding activity. Methods The CKM、CKB gene were amplified from plasmid we bough

4、t and insert into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with GST tag. The construct recombinant plasmid pGEX-4T-1-CKMB was transformed to E coli. BL21(DE3) for expression under induction of IPTG. The expressed fusion protein was purified by GST chromatography, then determined antigen-binding activ

5、ity by ELISA. Results PCR、restriction analysis and sequencing proved that recombinant pGEX-4T-1-CKMB was constructed correctly. The expressed recombinant fusion protein with relative molecular mass 110 000 showed specific binding to policolonal antibody against CKM and CKB. Conclution The CK-MB was

6、successfully expressed in prokaryotic cells and purified.Key words Humn creatine kinase-MB isoenzyme；Prokaryotic cells；Gene expression急性心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)患者存活率的關(guān)鍵是早期快速診斷，因為心肌細胞在梗死6 h后通常不可逆轉(zhuǎn)。對于診斷急性心肌梗死(AMI)，目前心肌標志物中的肌酸激酶(creatine kinase MB， CK-MB)質(zhì)量被視為診斷急性心肌梗死較敏感的指標之一1。肌酸激酶同工酶CK-MB

7、主要存在于心肌細胞中。急性心肌梗死(AMI)時心肌細胞受損，膜的完整性和通透性改變，使細胞內(nèi)的大分子逸出，能在外周血中被檢測到。這些大分子物質(zhì)被稱為心肌損傷標志物。在這些心肌標志物中CK-MB是升高較早，上升幅度較大的一種酶，也是迄今為止診斷AMI最佳且臨床上應(yīng)用最廣泛的血清酶指標之一。AMI后CK-MB于4 h升高，16 24 h達高峰 ，4872 h恢復正常，其升高程度能較準確地反映梗死的范圍，其高峰出現(xiàn)時間是否提前有助于判斷溶栓治療是否成功2-4。目前CK-MB質(zhì)量的檢測是采用免疫分析的方法，需要使用大量高質(zhì)量的標準品和抗體5-7。由于人CK-MB天然來源的有限性，通過基因工程重組CK-

8、MB來制備高質(zhì)量免疫原和標準品成為重要的途徑8-11。1、 材料與方法11 質(zhì)粒、菌株及細胞 原核表達載體PGEX-4T-1（含GST標簽）本實驗室保存；過渡載體pEASY-Blunt simple cloning kit和感受態(tài) Trans-TOP-1、E.coli BL21(DE3)購自TransGen公司，含CKM、CKB基因序列的質(zhì)粒SC319293、SC119007購自O(shè)rigene 公司。12 主要試劑及儀器PCR產(chǎn)物純化試劑和膠回收試劑購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI、XhoI及T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品； GST

9、親和層析柱購自GE公司；CK-B、CK-M多克隆抗體為華大蛋白公司產(chǎn)品； Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)、C1000 PCR儀、電泳儀及電泳槽為BIO-RAD公司產(chǎn)品。13 引物設(shè)計及合成 根據(jù)發(fā)表的人CK-B、CK-M基因序列設(shè)計引物如下：CK-B上游引物B1為5 CGCATATGCCCTTCTCCAACAGCCACAAC 3；CK-B下游引物B2為5 GCGAATTCTTTCTGGGCAGGCATGAGGTC 3；CK-M上游引物M1為5 CGGAATTCCCATTCGGTAACACCCACAAC 3； CK-M下游引物M2為5 GCCTCGAGCTTCTGGGCGGGGATCATGTC

10、 3劃線部分分別為Nde I、EcoR、EcoR和Xhol酶切位點。擴征片段大小為1041bp。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。14 CK-B、CK-M的基因擴增 以質(zhì)粒 SC319293為模板B1、B2為引物PCR擴增CK-B基因。以質(zhì)粒 S SC119007為模板，M1、M2為引物PCR擴增CK-M基因。反應(yīng)條件為94預變性5min、94變性30s，55退火30s，72延伸60s,30個循環(huán)后,72延伸7min，4保存。擴增產(chǎn)物取5l樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。15 pEASY-Blunt-CK-B/CK-M質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將膠回收得到CK-B，CK-M基因擴增產(chǎn)物與pEASY

11、-Blunt載體質(zhì)粒連接，構(gòu)建pEASY-Blunt-CK-B質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Trans-TOP-1，用含氨芐抗性的LB瓊脂平板培養(yǎng)基篩選陽性菌落，Nde I和EcoR/EcoR和Xhol雙酶切鑒定、并送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成測序。16 PGEX-4T-1-CKMB重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將鑒定正確的pEASY-Blunt-CK-B/CK-M質(zhì)粒經(jīng)Nde I和EcoR/EcoR和Xhol雙酶切、膠回收純化，與經(jīng)同樣雙酶的PGEX-4T-1質(zhì)粒在T4 DNA連接酶作用下，于室溫進行連接10min；聯(lián)結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)Trans-TOP-1。篩選陽性克隆經(jīng)PCR及酶切鑒定。 將驗證正確的PG

12、EX-4T-1-CK-M質(zhì)粒經(jīng)EcoR和Xhol雙酶切、膠回收純化小片段，并與經(jīng)同樣雙酶切的PGEX-4T-1-CK-B的質(zhì)粒在T4 DNA連接酶作用下，室溫連接10min，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)Trans-TOP-1。篩選陽性克隆進行PCR及酶切鑒定并送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成測序。17 CK-MB融合蛋白的誘導表達。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21（DE3），挑取陽性菌株，加入含Amp(100g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37增菌12h；再按1：100的比例加入到新鮮LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至菌體A600值為0.6-1.0時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，25誘

13、導6h，離心收集菌體，4超聲裂解，離心，分別收集上清和沉淀，進行8%SDS-PAGE分析。18 表達產(chǎn)物的純化 按照1.7的條件大量誘導表達融合蛋白，菌液6000rpm 離心30分鐘后，棄上清，將沉淀重懸于含一定濃度TritonX-100、二硫蘇糖、L-半胱胺酸的GST平衡緩沖液中，4超聲裂解后收集可溶性蛋白，用GST親和層析柱純化，洗脫、透析脫鹽處理后，經(jīng)SDS-PAGE分析純化效果。19 CK-MB抗原活性的鑒定采用酶聯(lián)免疫分析方法，即將重組表達的CKMB融合蛋白包被于酶標板上（100L/孔），然后加入一定濃度的CK-B/CK-M兔多抗，37溫浴1h，洗滌液洗滌3次后，加入一定濃度的HRP

14、-驢抗兔（100L/孔），37溫浴30min，洗滌3次后，加入顯色液（100L/孔），37溫浴15min，最后加入 2M硫酸（50L/孔）終止反應(yīng)，讀取OD450值。2、結(jié)果 21 CKM、CKB基因擴增產(chǎn)物的鑒定CK-M、CK-B基因PCR擴增產(chǎn)物取5L樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1041bp的特異條帶，見圖1。M：DNA Marker；1：CK-M基因PCR擴增產(chǎn)物；2：CK-B基因PCR擴增產(chǎn)物圖1 CK-M、CK-B 基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig 1. Electrophoretic profile of PCR product of CKMB gene2. 2重組原核表達質(zhì)

15、粒的鑒定重組表達質(zhì)粒PGEX-4T-1-CK-MB經(jīng)菌落PCR和雙酶切后（Nde I和 Xhol），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約2000bp的目的基因條帶，大小與預期一致，見圖2。序列分析結(jié)果顯示，得到的基因序列與預期完全一致。ABA：PCR鑒定（1：陽性克隆；2-8，10：陰性克隆；9：陰性對照；M：DNA Marker）；B：雙酶切鑒定（1，3：陰性質(zhì)粒；2，4：陽性質(zhì)粒；M ：DNA Marker）圖2 重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-CK-MB 的PCR及酶切（Nde I/Xhol I）鑒定Fig 2.Identification of recombinant plasmid PG

16、EX-4T-1-CK-MB by PCR and restriction analysis（Nde I/Xhol I）2. 3表達產(chǎn)物的鑒定8%SDS-PAGE 分析顯示，帶有GST標簽的PGEX-4T-1-CK-MB的誘導表達產(chǎn)物可見相對分子質(zhì)量約為110 000的特異蛋白表達條帶，大小與預期相符。主要以包涵體的形式存在。M：蛋白Marker；1-3：誘導表達重組菌的破菌上清；4：誘導表達重組菌的破菌沉淀圖3 CK-MB表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig 3.SDS-PAGE profile of expressed fusion protein2. 4重組CK-MB蛋白免疫活性測定酶聯(lián)免

17、疫分析結(jié)果顯示，重組的融合蛋白CK-MB與CK-M、CK-B多抗均能夠結(jié)合結(jié)合，證明重組蛋白具有免疫活性。圖4 CK-MB抗原結(jié)合活性鑒定Fig 4. Identification of antigen-binding activity fo CK-MB3、 討論肌酸激酶主要存在于動物的 心臟、骨骼肌及腦組織的細胞質(zhì)和線粒體中，參與細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運、肌肉收縮、ATP再生等過程。胞質(zhì)型肌酸激酶為二聚體酶，由M、B亞基分別聚合為 MM、MB、BB 3種同工酶形式。MM型主要存在于骨骼肌， 而BB型則是肌酸激酶在大腦中的主要存在形式，MB型則主要存在于心肌中。B型、M型亞基由381個 氨基酸組成，分子

18、量約為43 00012。本實驗室構(gòu)建了PGEX-4T-1-CK-MB/E. coli BL21(DE3) 原核表達系統(tǒng)，克隆表達的CK-MB在N端帶有分子量約為26 000道爾頓的GST標簽，使表達蛋白總大小達到約110 000。由于帶有GST標簽，可以用GST親和層析柱進行蛋白的純化。具有上樣量大提純效率高的特點，能夠方便快捷的得到大量純化重組蛋白?？乖Y(jié)合活性鑒定結(jié)果表明重組蛋白能夠和CK-M與CK-B的抗體結(jié)合，表明重組蛋白同時具有CK-M和CK-B的反應(yīng)原性。從實驗中可以看到使用該表達質(zhì)粒在合適的誘導條件下能夠表達出大量的蛋白，可以滿足大量生產(chǎn)使用的需求。但重組蛋白多以包涵體的形式存在

19、，為使重組蛋白接近天然蛋白的活性，我們還在進一步對重組蛋白進行復性研究和去GST標簽的研究。參考文獻1 廖俐雅，熊中政血清肌酸激酶同功酶MB的實驗室診斷進展J現(xiàn)代醫(yī)療衛(wèi)生，2007，23（10）：14722 賈思公血清肌鈣蛋白T與心肌酶譜指標聯(lián)合檢測用于急性心肌梗死診斷臨床價值淺析J中國實用醫(yī)藥，2012，7（3）：122-1233Leickt L, Grubb A, Ohlson SDevelopment of monoclonal antibodys against creatine kinase MB2JScand K Clin Lab Invest，2002,，62：423-4304

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