BCA蛋白濃度測定試劑盒完整版

1、BCA蛋白濃度測定試劑盒說明23225蛋白質(zhì)化驗(yàn)試劑盒：為500試管或5000微孔板的檢測提供充足的試劑 23227蛋白質(zhì)化驗(yàn)試劑盒：為250試管或2500微孔板的檢測提供充足的試劑 試劑盒組分：BCA 試劑A，1000 mL (No. 23225產(chǎn)品中) 或 500mL ( No. 23227產(chǎn)品中)，碳酸鈉， 碳酸氫鈉，二喹啉甲酸，酒石酸鈉溶于0.1 M氫氧化鈉中。BCA 試劑B , 25 mL, 包括4%硫酸銅一次性標(biāo)準(zhǔn)白蛋白, 2mg/ mL, 10 × 1 mL 安瓿, 包含2 mg/ mL牛血清白蛋白(BSA) 存在于0.9% 鹽和0.05%疊氮化鈉 中。儲(chǔ)存：以上試劑保

2、持在室溫下儲(chǔ)存和裝運(yùn)注意：如果試劑 A 或 試劑 B 在低溫下運(yùn)輸或長期儲(chǔ)存時(shí)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，可以通過緩慢加溫或輕輕攪拌溶液使沉淀物溶解。當(dāng)試劑變色或確定微生物污染時(shí)請丟球試劑盒。 目錄介紹.1準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)試劑和工作試劑.2準(zhǔn)備試管.3準(zhǔn)備微型版.3故障檢修.4有關(guān)美國熱電其他產(chǎn)品.5附加信息.5參考文獻(xiàn).6介紹美國熱電（Thermo）公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒 是基于二喹啉甲酸(BCA)通過比色檢測和定量測定總蛋白的洗滌劑兼容配方。該方法通過堿性介質(zhì)中的一種蛋白結(jié)合了Cu2使其顯著減少轉(zhuǎn)變?yōu)?Cu1 （縮二脲反應(yīng)）。用一種含二奎琳甲酸的試劑選擇性的比色法高敏感的比色杯中的Cu1. 這種測定方法

3、的紫色色反應(yīng)產(chǎn)物是通過BCA的兩個(gè)分子和亞銅離子螯合作用形成的。這種水溶性復(fù)合物在562nm 處有強(qiáng)吸收峰。在大的活性范圍內(nèi) (20-2000µg / mL）幾乎同蛋白濃度增加呈線性關(guān)系。BCA 法不是真正的終點(diǎn)的方法 ；也就是說，最終顏色繼續(xù)發(fā)展。孵化之后, 繼續(xù)的顏色發(fā)展速度是足夠慢以允許一起進(jìn)行測定大量樣本。大分子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),肽鍵的數(shù)量和存在的四個(gè)特定氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸，色氨酸和酪氨酸)據(jù)說是與BCA形成顏色產(chǎn)物的原因。因此,蛋白濃度的測量通常要參照標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)常見的蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白。一系列已知濃度的蛋白質(zhì)稀釋液是為與之相近的未知蛋白質(zhì)濃度測定準(zhǔn)備的。因?yàn)槊恳粋€(gè)未知濃

4、度的測定都需要基于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果需要將一個(gè)未知蛋白精確定量，選擇一個(gè)與未知蛋白特性相似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白是可取的。例如，當(dāng)測定免疫球蛋白時(shí)牛血清丙種球蛋白可以被當(dāng)做標(biāo)準(zhǔn)蛋白。以下給出了兩種檢測過程：其中,試管程序需要一個(gè)較大的體積(0.1毫升)的蛋白質(zhì)樣品。然而,因?yàn)樗褂昧艘粋€(gè)樣品比例為1:20的工作試劑(v / v),所以將干擾物質(zhì)的影響降到最小。在酶處理程序提供了一樣品處理酶，需要體積較小(10 -25µL)的蛋白質(zhì)樣品。然而,由于使用了樣品比例為1:8的工作試劑(v / v)，所以在克服干擾物質(zhì)濃度時(shí)靈活性降低，從而獲得的檢測水平較低。標(biāo)準(zhǔn)試劑和工作試劑的準(zhǔn)備（試驗(yàn)程序需要的兩個(gè)）A

5、 準(zhǔn)備稀釋的BSA標(biāo)準(zhǔn)液表1為導(dǎo)向,準(zhǔn)備一套蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。稀釋標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容為,將一個(gè)盛在安瓿管中的標(biāo)準(zhǔn)BSA稀釋到幾個(gè)潔凈的瓶子中,最好使用和樣本(s)相同量的稀釋劑。根據(jù)表1的建議：每1毫升的 安瓿管中加入2毫克/毫升的BSA標(biāo)準(zhǔn)液對于準(zhǔn)備一系列的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液是足夠的。每個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)三次也是足夠量的。 表一：準(zhǔn)備稀釋的BSA標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)試管協(xié)議和微型版程序的稀釋方案（活性范圍=20-2000µg/mL）加強(qiáng)試管協(xié)議的稀釋方案（活性范圍=5-250µg/mL） B：準(zhǔn)備BCA的工作試劑（WR）1.總共需要的WR的體積可以通過以下公式計(jì)算出來：（標(biāo)準(zhǔn)液+未知液）×（平行數(shù)

6、目）×（每個(gè)樣品中加入的WR體積）= 總共所需的WR體積例如：標(biāo)準(zhǔn)的試管程序有三個(gè)未知液，每個(gè)樣品做兩組重復(fù)：（標(biāo)準(zhǔn)液9mL+未知液3 mL）×（平行數(shù)目2）×（2 mL）=總共所需的WR體積48mL 注意：試管程序中每個(gè)樣品管加2.0ml WR微型版程序中每個(gè)樣品中只需要加200ul WR 2、WR的制備：（BCA 試劑A:B=50:1），對上述樣品,將50mL試劑A與1mL試劑B混合。 注意：當(dāng)試劑B加入到試劑A的開始，濁度觀察表明：混合后迅速消失變成澄清的綠色的。準(zhǔn)備充足的WR是基于所測樣品數(shù)量上的。如果將WR儲(chǔ)存在處于室溫（RT）的密閉容器中，那么幾天之內(nèi)

7、WR是穩(wěn)定的。簡要步驟（試管程序，標(biāo)準(zhǔn)方案）試管程序（樣品：WR =1:20）1、 用移液管移取每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和所測樣品的重復(fù)0.1ml到有標(biāo)簽的對應(yīng)試管中。2、 在每個(gè)管中加2.0ml的WR，混勻。3、 封口，然后溫育試管（選擇時(shí)間和溫度）1）標(biāo)準(zhǔn)方案：37 30min(working range=20-2000ug/ml)2）RT方案：RT 2h(working range=20-2000ug/ml)3）Enhanced Protocol(加強(qiáng)方案)：60 30min(working range=5-250ug/ml)注意：每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都增加培育時(shí)間和溫度，增加的凈吸光度，降低試劑的最低檢測水平

8、和方案的工作范圍；使用水浴加熱管要么是標(biāo)準(zhǔn)(37°C培養(yǎng))或是增強(qiáng)(60°C 培養(yǎng))協(xié)議。使用強(qiáng)制的培養(yǎng)可能會(huì)因?yàn)闊醾鬟f不均勻使其在顏色變化上引進(jìn)明顯的誤差。4、 使所有管子冷卻至室溫5、 分光光度計(jì)設(shè)定在562nm，當(dāng)比色皿中裝的是水時(shí)給儀器校零。隨后，確保在10min內(nèi)測完所有樣品的吸光度。注意：因?yàn)锽CA測定不是真正的終點(diǎn)，即使冷卻到室溫顏色還會(huì)繼續(xù)變化。然而，由于在室溫下顏色變化速度比較慢，所以如果在10min內(nèi)測完所有試管的吸光度就不會(huì)引進(jìn)明顯的誤差。6、 所有的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與所測的樣品重復(fù)在562nm測得的吸光度都要減去在562nm測得的所有空白標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度平均

9、值。微型板程序（樣品：WR =1:8）1、 用移液管移取25ul的WR到每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品所在的微型板中（working range=20-2000ug/ml）注意：如果樣品大小被限制為：每個(gè)未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)品只能使用10ul（sample toWR ratio=1:20）.然而，被測量的working range在這種情況下將被限制為125-2000ug/ml。2、 每個(gè)孔中加200ul的WR，用plate shaker混30s，使其徹底混勻3、 封口，溫育 37 30min4、 冷卻到室溫5、 用酶標(biāo)儀測量在562nm或接近562nm的讀數(shù)注意：1）這種方法中波長在540-590nm的范

10、圍內(nèi)都能被成功的測量2）因?yàn)樽x板器使用的光線長度比分光光度計(jì)的比色皿要短，所以微型板程序需要使用樣品比例比較大的工作試劑去獲得與標(biāo)準(zhǔn)試管程序相同的靈敏度。如果需要高于562nm的測量，要將培養(yǎng)時(shí)間增加到2h.3）增加培養(yǎng)時(shí)間或樣品工作試劑的體積比率，增加每個(gè)well在562nm的凈測量值，降低實(shí)際的最低測量水平和測量的working range。只要每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣與未知樣都被同等對待，這樣的修改也是有益的。6、所有的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與所測的樣品重復(fù)在562nm測得的吸光度都要減去在562nm測得的所有空白標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度平均值。7、準(zhǔn)備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線通過繪制每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)BSA在562nm測量的相對于空白對照的

11、吸光度平均值。它ug/ml的濃度。使用標(biāo)曲去測量每一個(gè)未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意：如果聯(lián)系微型板讀數(shù)器使用擬合的曲線算法，一個(gè)有四個(gè)參數(shù)的或最合適的曲線將提供比純線性狀態(tài)更精確的結(jié)果。如果用手繪制這個(gè)結(jié)果，一個(gè)點(diǎn)-分曲線將比線性更加適合標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。A：干擾物質(zhì)某些物質(zhì)干擾BCA檢測是已知的，包括潛在的還原劑，螯合劑，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿。因?yàn)樗麄兛梢愿蓴_估算蛋白質(zhì)每分鐘濃度, 作為樣品緩沖液的組份應(yīng)避免下列物質(zhì)：抗壞血酸 EGTA 鐵 不純的蔗糖兒茶酚胺 不純的甘油 脂質(zhì) 色氨酸肌酸酐 過氧化氫 蜜二糖 酪氨酸半胱氨酸 酰肼類 苯酚磺酞 尿酸其他物質(zhì)對BCA法檢測蛋白量有較少程度的干擾。并且這些在原來的樣本

12、中低于一定濃度只有很小的影響（可以容忍）。許多物質(zhì)的最大兼容的濃度在標(biāo)準(zhǔn)測試管協(xié)議中被列出。表 2 （見說明的最后一頁）。物質(zhì)是兼容與標(biāo)準(zhǔn)測試管協(xié)議中指定的濃度，如果蛋白濃度的估計(jì)的誤差是由物質(zhì)的存在所造成將會(huì)小于或等于 10 。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)之前，這些物質(zhì)都會(huì)用現(xiàn)配的WR進(jìn)行測試?？瞻仔Ｕ脑?62nm的吸光度測量值（1000µg / mL白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品+物質(zhì)）將會(huì)同0.9%生理鹽水中精確配制的標(biāo)準(zhǔn)品在562nm出的凈吸光度進(jìn)行比較。樣品：WR為1： 8 (v/v)的微孔板過程中最大兼容濃度將比較低。B .消除或減少干擾物質(zhì)影響的,策略BCA蛋白含量測定中干擾物的影響可以用以下幾個(gè)方法

13、消除或克服。 通過透析或凝膠過濾去除干擾物質(zhì)。 稀釋樣品,直到不再有干擾。這種策略只在起始蛋白質(zhì)濃度足夠多余稀釋后仍在檢測活性范圍之內(nèi)是有效的。 用丙酮酸或三氯乙酸(TC A) 沉淀樣品中蛋白質(zhì)。液體包含干擾物質(zhì)將被丟棄，蛋白沉淀很容易在超純水中溶解或直接用堿性BCA WR溶解。這一方案的詳細(xì)流程可從我們網(wǎng)站獲得。另外, 23215號(hào)產(chǎn)品將被使用 (見相關(guān)Pierce產(chǎn)品)。 適當(dāng)?shù)脑黾覹R中銅的量 (準(zhǔn)備WR試劑A:B為 50:2 或50:3、),這將減少銅螯合劑的干擾注意:為了最大限度的精確度,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品必須和樣品(s)同樣處理。有關(guān)美國熱電其他產(chǎn)品15041 96孔板100/pkg15

14、075 試劑水庫200/pkg.15036 96孔板密封帶100/pkg.23209 標(biāo)準(zhǔn)白蛋白安瓿2mg/ mL 10×1毫升安瓿,包含牛血清白蛋白23208 預(yù)稀釋的蛋白質(zhì)檢測標(biāo)準(zhǔn)品：牛血清白蛋白集合，7 × 3.5mL23212 牛伽瑪球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品2 mg/mL, 10 × 1 mL安瓿23235 微型BCA蛋白檢測試劑盒工作范圍為0.5-20µg / mL23236 考馬斯亮藍(lán)檢測試劑盒，工作范圍的1 - 1500µg /mL23215 Compat- Able 蛋白檢測試劑組23250 BCA蛋白檢測試劑盒-兼容還原劑附加信息A請?jiān)L問我們的網(wǎng)站了解更多的信息,包括下列事項(xiàng):常見問答技術(shù)指導(dǎo)：消除樣品中干擾物質(zhì)對蛋白質(zhì)檢測的影響B(tài) .替代總蛋白檢測試劑如果不能克服樣品中還原物或金屬螯合物的干擾。由一個(gè)減少物質(zhì)或metal-chelating物質(zhì)包含在,試試美國熱電公司的23236號(hào) 考馬斯亮藍(lán)檢測試劑盒，它對這些物質(zhì)較不敏感。C. 玻璃器皿的清潔和重利用小心謹(jǐn)慎使用玻璃器皿。所有的玻璃器皿必須清洗和最后的超純水沖洗。D、不同的蛋白質(zhì)的反應(yīng)特征常用的總蛋白含量測定方法某種程度上顯示了不同蛋白的不同反應(yīng)。這些差異源于氨基酸序列的不同、等電點(diǎn)、 結(jié)構(gòu)和某些側(cè)鏈或輔基的存在都可以大大