無機氮濃度及其配比對細基江蘺繁枝變型(Gracilaria

1、無機氮濃度及其配比對細基江蘺繁枝變型(Gracilaria tenuistipitata var. liui)生長及生化組成的影響作者：黃鶴忠 學號：D05032 導師：梁建生提要：在實驗室條件下分別研究了NO3-N和NH4+-N濃度及其配比對細基江蘺繁枝變型(Gracilaria tenuistipitata var liui Zhang et Xia) (以下簡稱“江蘺”)生長及生化組成的影響。結果表明：過低的NO3-N濃度 (0,10mol/L) 或過高的NO3-N濃度(60,80mol/L)、過低的NH4+-N濃度(0,2.5mol/L) 或過高的NH4+-N濃度(10,20,40mo

2、l/L)、過低的NH4+-N/NO3-N比值(1/35,1/7)或過高的NH4+-N/NO3-N比值(3/7,4/7)營養(yǎng)條件下，江蘺均表現為生長速率明顯減慢(P<0.05)、藻體內藻紅素(PE)、葉綠素a、蛋白質含量顯著降低(P<0.05)；而分別在NO3-N20mol/L、NH4+-N5mol/L、NH4+-N/NO3-N2/7(TIN20mol/L)的營養(yǎng)環(huán)境條件下，江蘺可獲得最快生長速率和最高的PE、葉綠素a、蛋白質含量以及最低的碳水化合物/蛋白質比值。關鍵詞：無機氮；江蘺(Gracilaria tenuistipitata)；生長；生化組成EFFECTS OF DIFFE

3、RENT INORGANIC NITROGEN SOURCES AND CONCENTRATIONS ON THE GROWTH AND BIOCHEMICAL CONSTITUENTS OF Gracilaria tenuistipitata var. liui Abstract：In order to investigate the effects of different inorganic nitrogen sources and concentrations on the growth and the biochemical constituents in macroalgae, G

4、racilaria tenuistipitata var liui Zhang et Xia was cultured with varied nitrogen sources(NO3-N, NH4+-N and NH4+-N/NO3-N)and at different concentrations in laboratory. The results showed that Gracilaria growth was inhibited considerably(P<0.05) and the contents of PE and Chl-a and protein were res

5、pectively lower then control(P<0.05), when NO3-N concentrations were 0, 10, 60 and 80mol/L, or when NH4+-N concentrations were 0, 2.5, 10, 20 and 40mol/L, or when levels of NH4+-N/NO3-N were 1/35, 1/7, 3/7 and 4/7. At suitable nitrogen environment (NO3-N20mol/L, NH4+-N5mol/L, NH4+-N/ NO3-N 2/7 an

6、d TIN20mol/L), the Gracilaria showed the best growth and the highest level of of PE and Chl-a and protein and the lowest value of carbohydrate/protein ratio then other groups(P<0.05), respectively.Key words：inorganic nitrogen, Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia, growth, biochemical

7、constituent在自然條件下，海藻的生長和海藻體內的化學組成既受光照、溫度及鹽度等因子的調節(jié)，又受到海水中營養(yǎng)鹽水平的制約，氮是藻類生長繁殖所必需的主要營養(yǎng)元素之一，在許多海區(qū)氮成了藻類生長的限制因子1。氮在海洋中的形態(tài)較多，除溶解的無機態(tài)(NO3-、NO2-、NH4+)和有機態(tài)(PON、DON)，還存在著氣態(tài)的N2、N2O和NH3，其中NO3-N和NH4+-N是海藻生長繁殖所利用的最主要的氮源。細基江蘺繁枝變型(Gracilaria tenuistipitata var. liui)是紅藻門江蘺屬中一種重要的產瓊膠紅藻，不但具有巨大的潛在經濟利用價值，而且因其具有適應廣(耐高溫等)、生

8、長快(繁殖方便、增殖快速、生物量大等)、營養(yǎng)儲存庫大等特點，在海藻生物修復富營養(yǎng)化水域、防止海區(qū)赤潮等方面具有獨特的應用價值。然而，國內外有關不同NO3-N和NH4+-N濃度及其配比對細基江蘺繁枝變型 (以下簡稱“江蘺”)生長及生化組成影響方面的研究尚未見到報道。本文對此作了研究，以期為江蘺栽培的營養(yǎng)環(huán)境調控及其資源利用提供有益的參數。1 材料與方法1.1 材料 實驗用細基江蘺繁枝變型(Gracilaria tenuistipitata var. liui)取自南通市某海水養(yǎng)殖池塘，選擇健康藻體，用鑷子仔細除去表面附著的雜藻，最后用大量消毒海水沖洗以后，放在室內水族箱擴大培養(yǎng)，海水經煮沸消毒后

9、添加PES加富培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為22±1，光照強度4 000 lx，光周期12L : l2D，鹽度21(自然海水經蒸餾水稀釋)，pH為8.0。在正式開始分組實驗前，將江蘺在煮沸消毒后的天然海水中(不加PES)培養(yǎng)10天至培養(yǎng)液中N消耗盡后，用于正式實驗用水；同時，藻體色澤逐漸變淡黃色，使藻體呈饑餓狀態(tài)。分組后在各自硝態(tài)氮濃度下先預培養(yǎng)4小時并更換培養(yǎng)液后，正式開始生長、生理和生化等實驗。1.2 生長實驗的設計與測定方法 實驗設置了6個硝態(tài)氮(NO3-N)濃度組(0、10、20、40、60、80mol/L)，每組分別設三個平行，各組氮以外的其它營養(yǎng)鹽成分一律采用f/2營養(yǎng)鹽，其它實驗環(huán)

10、境條件同擴大培養(yǎng)條件，采用250 ml燒杯(200 ml培養(yǎng)液)，每個燒杯中加入相同部位的江蘺0.5g，每天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)10天。用濾紙吸干藻體表面的水分，稱濕重；藻體于70恒溫干燥48h測干重。用下列公式計算特定生長率(SGR):SGR=(Wt/ W0)1/t-1×100%(W0為初始江蘺的鮮重，Wt為實驗結束時江蘺的鮮重，t實驗持續(xù)的天數)。1.3 生化組分實驗的設計與測定方法江蘺的分組和培養(yǎng)方法同上，培養(yǎng)3天后按以下方法測定藻體內藻紅素(PE)、葉綠素a、碳水化合物及蛋白質的含量。藻紅素含量測定，用純水快速沖洗藻體，用濾紙吸干水分，取0.15g(濕重)加2 ml 0.1 mo

11、l/L磷酸緩沖液(pH=6.5)，小研缽冰浴勻漿，臺式離心機低溫(4)4 000r/min離心20min，沉淀用于葉綠素a的分析，取上清液以磷酸緩沖液為空白，測565nm處的光密度。藻紅素(PE)含量的計算用下列公式2：PE =12.4×A565×Ve/(I×DW×1000)PE為藻紅素濃度(mg/g.dw)；12.4為藻紅素吸收系數的倒數(mg/L)；A565為565mn處的光密度值；Ve為萃取液的體積(3m1)；I為比色皿光徑(cm)。 葉綠素a含量測定，參考Moran等3方法，將上述沉淀物加入3m1 N，N二甲基甲酰胺(DMF)，4萃取24h，4

12、000r/min離心10min，以DMT為空白，測625、647、664和750nm處的光密度，750nm處的光密度用于校正其它物質的吸收值。計算葉綠素a(Chla)含量的公式為:Chla=(12.65A664-2.99A647- 0.04A625)×Ve/ (I×DW×1000)Chla為葉綠素a濃度(mg/g.dw) ；A565、A647、A625分別是625， 647和664nm處的光密度值；Ve為萃取液的體積(3ml)；I為比色皿光徑 (cm)。碳水化合物含量采用硫酚法4測定，碳水化合物的含量()=C×V/W×1000×aC代

13、表葡萄糖標準曲線中查得的值(g)；V代表樣品提取液體積(ml)；a代表顯色時取樣品液量(ml)；W代表樣品質量(g)蛋白質含量測定，取0.2g藻(濕重)，冰浴研磨，離心，考馬斯亮藍法測定5。樣品中蛋白質的含量(g/g)=C×Vt/V1×FW×1000C為查得的小牛血清標準曲線值(g)；Vt為提取液總體積(ml)；FW為樣品鮮重(g)；V1為測定時加樣量(ml)。碳水化合物和蛋白質的含量均以占干重的%表示。1.4 統(tǒng)計分析將所有測定數據用SPSS10.0軟件包按單因子方差統(tǒng)計方法分析各組間生長和生化指標的差異顯著性。2 結果2.1不同NO3-N濃度對江蘺生長及生化組

14、成的影響 由表1可以看出，在NO3-N濃度為0mol/L時，其SGR最低，為0.81，江蘺生長緩慢；NO3-N濃度為20mol/L時，江蘺的特定生長率(SGR) 為7.61，顯著高于其他各組(P<0.05)；NO3-N濃度20mol/L時，江蘺SGR隨著NO3-N濃度的增加而逐漸升高(P<0.05)；而當NO3-N濃度20mol/L 時，江蘺SGR隨著NO3-N濃度的增加而顯著降低(P<0.05)。由表1還可以看出，江蘺體內藻紅素、葉綠素a的含量隨水體中NO3-N濃度的變化規(guī)律是一致的，其藻紅素和葉綠素a含量由高到低所對應的環(huán)境NO3-N濃度依次為20=40>60>

15、;80>10>0(mol/L) (P<0.05)。表1還顯示，江蘺體內蛋白質和碳水化合物的含量隨水體中NO3-N濃度的變化規(guī)律恰好相反，水體中NO3-N濃度為20mol/L時江蘺體內蛋白質含量最高而碳水化合物的含量最低(P<0.05)；水體中NO3-N濃度為0mol/L時江蘺體內碳水化合物的含量最高而蛋白含量最低(P<0.05)。表1 不同NO3-N濃度對江蘺生長及生化組成的影響(Mean±SD)Tab.1 The growth and biochemical constituents of the Gracilaria at different lev

16、els of NO3-N硝氮濃度(mol/L)01020406080SGR()0.81±0.19e5.06±0.13d7.68±0.23a7.04±0.21b6.53±0.12c5.17±0.13d藻紅素(mg/g.dw)6.03±0.10e9.32±0.11d13.60±0.12a13.36±0.08a12.41±0.09b10.23±0.06cChla(mg/g.dw)2.12±0.12e2.87±0.31d4.03±0.15a3.90

17、77;0.08a3.59±0.03b3.21±0.11c可溶蛋白質()12.01±0.16f15.14±0.14c17.32±0.21a16.03±0.23b14.30±0.18d13.21±0.24e碳水化合物()51.26±0.16a47.91±0.24c44.11±0.21f45.70±0.16e47.06±0.11d49.31±0.21b碳水化合物/蛋白質4.273.162.552.853.293.73注：同一行數據右上角不同小寫字母表示有顯著差異

18、(P<0.05)，(n=3)。下表相同。Note: Different small letters in the top right corner mean significant differences. Follows table is same mean.2.2 不同NH4+-N濃度對江蘺生長及生化組成的影響由表2顯示，江蘺SGR、藻紅素含量、葉綠素a含量、蛋白質含量及碳水化合物含量隨NH4+-N濃度的變化規(guī)律與隨NO3-N濃度的變化規(guī)律(表1)基本相同，江蘺SGR由高到低隨NH4+-N濃度的變化規(guī)律依此為：5>10>20>2.5=40>0(mol/L) (

19、P<0.05)。水體NH4+-N濃度為5和10mol/L時江蘺體內藻紅素、葉綠素a的含量顯著高于其他各濃度組(P<0.05)；水體NH4+-N濃度為5mol/L時，江蘺體內蛋白質的含量在各組中最高而碳水化合物的含量為最低(P<0.05)。表2 不同NH4+-N濃度對江蘺生長及生化組成的影響(n=3)(Mean±SD)Tab.2 The growth and biochemical constituents of the Gracilaria at different levels of NH4+-N銨氮濃度(mol/L)02.55102040SGR()0.81

20、77;0.21e4.01±0.20d6.52±0.17a5.58±0.16b4.74±0.17c3.88±0.15d藻紅素(mg/g.dw)6.11±0.13c8.30±0.11b9.61±0.13a9.23±0.11a8.35±0.07b6.22±0.05cChla(mg/g.dw)2.09±0.17d2.57±0.27c3.53±0.14a3.51±0.26a3.07±0.13b2.53±0.12c可溶蛋白質()13.17

21、±0.13c14.81±0.24b15.96±0.17a14.65±0.25b14.57±0.14b11.32±0.26d碳水化合物()49.75±0.14a47.62±0.31b43.72±0.25e45.94±0.13d46.46±0.18c47.34±0.23b碳水化合物/蛋白質3.783.222.713.143.194.182. 3 不同NH4+-N/NO3-N對江蘺生長及生化組成的影響從表3可知，隨著水體NH4+-N/NO3-N比值的逐漸增加，江蘺SGR、藻紅素含量

22、、葉綠素a含量、蛋白質含量均呈現先升高后下降的趨勢。當NH4+-N/NO3-N為2/7時，江蘺SGR、藻紅素含量、葉綠素a含量、蛋白質含量最高且均顯著地高于其他各組(P<0.05)；而當NH4+-N/NO3-N為4/7時，則上述指標均為最低。由表3顯示，江蘺體內碳水化合物含量對水體中NH4+-N/NO3-N比值變化的響應規(guī)律與蛋白質含量等的響應規(guī)律有所不同，江蘺體內碳水化合物含量最高或最低所對應的水體中NH4+-N/NO3-N值分別為4/7 (P<0.05)和1/7 (P<0.05)。表3 不同NH4+-N/NO3-N比值對江蘺生長及生化組成的影響(n=3) (Mean

23、77;SD)Tab.3 The growth and biochemical constituents of the Gracilariaat different levels of NH4+-N/NO3-N銨/硝比1/351/72/73/74/7.SGR()7.20±0.13c7.88±0.13b8.41±0.11a7.13±0.13c6.17±0.12d藻紅素(mg/g.dw)13.62±0.09c14.43±0.10b15.25±0.11a11.54±0.08d11.26±0.07dChl

24、a(mg/g.dw)4.02±0.15c4.53±0.15b4.96±0.09a3.89±0.07c3.01±0.09d可溶蛋白質()17.45±0.17c18.34±0.15b19.72±0.20a17.33±0.16c14.27±0.19d碳水化合物()45.83±0.12c44.14±0.18d46.75±0.15b46.91±0.24b49.35±0.31a碳水化合物/蛋白質2.632.412.372.713.46 3 討論從本實驗結果可

25、以看出，水體中不同NH4+-N濃度、NO3-N濃度和NH4+-N/NO3-N對江蘺生長及生化組成具有顯著影響；江蘺分別在NO3N 20mol/L、NH4+-N 5mol/L、NH4+-N/NO3-N 2/7 (TIN 20mol/L)的營養(yǎng)環(huán)境條件下，可獲得最快生長速率和最大的PE、葉綠素a、蛋白質含量以及最低的碳水化合物/蛋白質比值。水體中過高或過低的NH4+-N濃度、NO3-N濃度和NH4+-N/NO3-N均不利于江蘺生長，同時藻體內藻紅素(PE)、葉綠素a和蛋白質的含量相應降低，而江蘺體內碳水化合物含量和碳水化合物/蛋白質隨之增高。這與邱昌恩等6在高N條件下(4.50030.000g/L

26、)培養(yǎng)的綠球藻(Chlorococcum sp.)生長減緩甚至停滯，并且綠球藻Chla+Chlb的含量呈逐漸減少趨勢的結果相似；本實驗結果顯示，江蘺在單獨以NH4+-N為氮源時的最大SGR為6.52%(NH4+-N 5mol/L)，比單獨以NO3-N為氮源時的最大SGR 7.68% (NO3-N 20mol/L)低15.10%，更比混合銨硝氮源時的最大SGR 8.41% (NH4+-N/NO3-N為2/7，TN 20mol/L)低了22.47%，與顏天等報道的NH4+-N(550mol/dm3)使微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、海洋原甲藻(Prorocentrum mi

27、can)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、海洋角管藻(Cerataulina pelagica)和微小細柱藻(Leptocylindrus minimus) 停止生長7,8 的情形和張清春等9報道在氮饑餓條件下加入硝酸鈉能顯著促進微小亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的生長，而高濃度的氯化銨對微小亞歷山大藻有一定的毒性效應，表現為生長停滯的研究結果相似。高濃度NH4+-N會抑制藻類生長的原因可能是高濃度的NH4+-N處理使植物的耗氧量增加41%，推測把NH4+從細胞內運出細胞時要耗費巨大的能量11；可以推測，水體NH4+-N含量的升高，對江蘺會形成

28、氨逆境脅迫，產生氨害，從而影響了江蘺的正常生理活動，使生長減慢，作者在供氮種類和水平對江蘺抗氧化酶活性影響的研究中也得到了證實(另篇報道)；本試驗結果也表明，適宜比例的銨硝氮混合氮源相比單一的NO3-N或NH4+-N氮源而言，不但更有利于江蘺的生長，而且其體內藻紅素和蛋白質含量較高，同時碳水化合物/蛋白質比值較低，暗示在適合的混合銨硝氮源條件下江蘺體內氮代謝途徑有利于通過合成谷胺酰氨途徑進行解毒12并向蛋白質方向轉化。由于細基江蘺蛋白質含量在一定程度上反映了其體內色素含量和酶水平10，因而表明，水體適宜的氮營養(yǎng)供應有利于海藻體內光合色素的形成和生理活性酶等蛋白質的含量的提高。本實驗結果顯示，盡

29、管江蘺對NH4+-N的吸收速率要比NO3-N大，并存在優(yōu)先吸收NH4+-N的現象13，但是單一的NH4+-N或高比例的NH4+-N/NO3-N反而比單一NO3-N供應更不利于江蘺的光合色素積累和生長，這可能是由于NO3-N是海洋溶解態(tài)無機氮(DIN) 中最主要的組成成分，存在的量通常遠高于NH4+-N及NO2-N。大量研究表明，硝酸鹽是許多海區(qū)藻類生長的主要原料，藻類可利用周圍環(huán)境中的硝酸鹽作為氮源，經過一系列酶的還原作用，將硝酸鹽一步步轉化成為氨氮后，作為合成有機物質的原料14。本實驗結果也證明，盡管許多大型海藻對環(huán)境中營養(yǎng)鹽的變動產生了很好的適應性，它們在外界營養(yǎng)鹽豐富的情況下對其吸收的最

30、大速率遠遠大于維持最大生長速率所需要的氮，從而積累了豐富的體內營養(yǎng)庫以備環(huán)境中營養(yǎng)鹽不足時用于生長的需求13，而非立即全部用于體內的代謝和生長。參考文獻1Carpenter E J，Capone D G(eds)Nitrogen in the marine environment. New York: Academic Press，1983，4875122達維斯C，J海洋植物學廈門大學植物生態(tài)學研究室譯. 廈門大學出版社，1989，2583Moran RFormulae for determination of Chlorphyllous pigments extracted with N, N-dimethyformamidePlantphysiol, 1982, 69: 137613814Dubios M K. Colorimetric method for determination of sugar and related substances. Anlyt Chem, 1956, 28: 3503565鄒崎. 植物生理學實驗指導，中國農業(yè)出版社，2000，1296邱昌恩，況琪軍，劉國祥等