氨基酸測(cè)定方法

1、4.1 光度分析法5 6-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的條件下可以生成藍(lán)紫色物質(zhì)7，其顏色深淺主要與-氨基丙酸的濃度有關(guān)。因此可利用此顯色反應(yīng)采用比色法定量測(cè)量-氨基丙酸。我在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)很多因素如濃度、pH值、反應(yīng)溫度、以及反應(yīng)時(shí)間等對(duì)此顯色反應(yīng)有很大的影響。如忽視這些因素會(huì)使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生很大的誤差。就此顯色反應(yīng)的最佳條件我做了初步的探究。4.1.1試劑的配制：緩沖液的配制：配制pH= 6.00的NaAcHAc緩沖溶液 -氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取1.020 g-氨基丙酸(生化純)，溶于250ml pH=6.00緩沖溶液中，得到C = 4.080 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。茚三酮試劑的配制：稱(chēng)

2、取0.5g茚三酮溶于100ml蒸餾水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。4.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定分別準(zhǔn)確移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml標(biāo)準(zhǔn)液于8個(gè)比色管中，用pH=6.00的緩沖溶液稀釋到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分搖勻，將其放在沸水浴中加熱10min。冷卻到室溫，用7230型分光光度計(jì)在569nm下測(cè)其吸光度。以吸光度和濃度作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.1.3樣品的測(cè)定稀釋待測(cè)液于0.24mg/ml0.73mg/ml,調(diào)pH值到6.00，以相同的反應(yīng)條件，測(cè)其吸光值并與上面的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照查出稀釋液的濃度，再乘以

3、稀釋倍數(shù)即為-氨基丙酸的濃度。4.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果-氨基丙酸濃度在0.24mg/ml0.73mg/ml范圍內(nèi)與茚三酮水溶液反應(yīng)，顏色表現(xiàn)出由淺藍(lán)到深藍(lán)的遞增變化。用茚三酮比色法測(cè)得的一組數(shù)據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1：圖 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定Fig 1 Determination of the standard curve注：在沸水中加熱10min，-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、緩沖溶液pH=6.004.1.5樣品的測(cè)定分析將待測(cè)的一批稀釋50倍，母液稀釋的程度可以根據(jù)以與標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同的反應(yīng)條件下反應(yīng)，再觀察樣品的顯色程度而確定。取稀釋后的產(chǎn)物液1ml,用pH=6.00的緩

4、沖液稀釋到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加熱10min,測(cè)得如下數(shù)據(jù)如表3：表3 樣品的測(cè)定Table 3 Determination of sample待測(cè)液序號(hào)待測(cè)液所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間吸光度A110h0.320220h0.710322h0.5624.1.6 濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)表明，-氨基丙酸與茚三酮水溶液在表3所注的條件反應(yīng)的最低濃度為0.24mg/ml，隨著-氨基丙酸的濃度變大顯色逐漸變深。當(dāng)濃度大于0.73mg/ml時(shí)，所顯顏色過(guò)深或生成紫色化合物影響其吸光度。當(dāng)-氨基丙酸的濃度在0.24mg/m0.73mg/ml時(shí)，顏色變化明顯而且穩(wěn)定，因此，我選定此濃度范圍作為測(cè)定

5、范圍。得到的數(shù)據(jù)如表4：表4 濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響Table 4 Concentration on the color reaction標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mg/ml)0.140.240.600.730.89顏色變化基本無(wú)色淺藍(lán)藍(lán)深藍(lán)藍(lán)紫吸光度A0.0460.4000.7461.2721.120注：在沸水中加熱10min，標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為5ml,加入1ml茚三酮水溶液。4.1.7 pH值對(duì)顯色反應(yīng)的影響8 以1.5mg/ ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加熱10min,觀察到的顏色變化如 表5：表 5 pH值對(duì)顯色反應(yīng)的影響Table 5 The influence of pH

6、on the color reactionpH值3.425.015.165.435.506.007.449.0510.30顏色無(wú)色淺藍(lán)淺藍(lán)藍(lán)藍(lán)深藍(lán)紅棕色紅棕色紅棕色注：在沸水中加熱10min，-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml、茚三酮水溶液1ml、緩沖溶液Ph=6.00顯色反應(yīng)隨著pH值得不同，顏色有著明顯的變化。當(dāng)pH值小于3.42時(shí)幾乎無(wú)色，而在pH值在3.787.44時(shí)顏色變化明顯。pH值為6.00，加熱不到二分鐘即顯色；pH值為9.05，加入茚三酮溶液后不加熱30s左右即顯紅棕色；茚三酮水溶液在強(qiáng)堿的條件下帶有明顯的淡黃色。因此pH值為6.00左右最好。故我選定pH值為6.00。此時(shí)顯色明顯無(wú)干

7、擾且穩(wěn)定。4.1.8溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響：實(shí)驗(yàn)表明：溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)此顯色反應(yīng)的影響很大。溫度太低，反應(yīng)太慢導(dǎo)致顯色時(shí)間長(zhǎng)，而且顯色效果不好。而溫度過(guò)高，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)對(duì)此反應(yīng)影響也很大，會(huì)生成紫色化合物影響其吸光度。在顯色反應(yīng)中，反應(yīng)時(shí)間主要根據(jù)具體的顏色變化而定。一般來(lái)說(shuō)，-氨基丙酸濃度在0.24mg/ml0.73mg/ml時(shí)，在沸水中加熱10min即可，時(shí)間太短，反映不完全顏色梯度不明顯。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶液揮發(fā)嚴(yán)重也影響其吸光度。故我把反應(yīng)時(shí)間定在10min左右。4.1.9其他因素的影響不同溶劑的茚三酮溶液對(duì)顯色反應(yīng)也有一些影響。為了區(qū)別它們對(duì)顯色反應(yīng)的影響，我做了如下實(shí)驗(yàn)：分別稱(chēng)取0.2002

8、g茚三酮三份，分別溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以觀察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取-氨基丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值為6.00的NaAcHAc緩沖溶液稀釋到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加熱。實(shí)驗(yàn)表明：在加熱2min時(shí)，乙醇溶液開(kāi)始顯色；丙酮溶液的顯紅棕色；水溶液無(wú)色。在加熱6min時(shí)，丙酮溶液的顏色加深；水溶液顯淺藍(lán)色；乙醇溶液的所顯顏色最深。乙醇易揮發(fā)，在加熱的條件下?lián)]發(fā)更嚴(yán)重?；谶@一點(diǎn)的考慮，我采用茚三酮水溶液。而茚三酮的用量對(duì)此顯色反應(yīng)的影響不大，可以選擇5ml的被測(cè)液與1ml(5g/l)的茚三酮水溶液

9、反應(yīng)。測(cè)定時(shí)，最好選擇標(biāo)樣與待測(cè)液在同一水浴。這樣可以減少誤差提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。另外，當(dāng)被測(cè)液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，影響測(cè)定結(jié)果。總之，茚三酮比色法作為一種-氨基丙酸的定量檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。只要控制好反應(yīng)條件就能得到較好的測(cè)量結(jié)果。三茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成蘭紫色化合物。可以用比色法定量測(cè)定。2試劑：（1）磷酸緩沖液（pH.8.04）制備方法如下：稱(chēng)磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml稱(chēng)NAH2PO4·12H2O   11.9380g分別溶解定容500ml取磷酸二氫

10、鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液（2）2%茚三酮溶液：稱(chēng)茚三酮1g溶于35ml熱水加入40mg氯化亞錫（SnCl2·H2O）攪拌過(guò)濾（作防腐劑）于冷暗處過(guò)夜定容50ml  氨基酸標(biāo)液稱(chēng)干燥氨基酸（如異亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml搖勻吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml標(biāo)液3操作方法：（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取7個(gè)25ml容量瓶，吸取標(biāo)液 0   0.5   1.0   1.5   2.0  

11、; 2.5   3.0ml于7個(gè)25ml容量瓶，加水補(bǔ)充至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測(cè)消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）樣品測(cè)定：取樣品5.0010.0g（液體樣5-10ml）于燒杯中加50ml水和活性碳約5g加熱過(guò)濾用3040ml熱水洗滌活性炭吸澄清樣液14ml加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測(cè)定消光值，按下式計(jì)算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W×1000）×100C從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量（Ug）W測(cè)定得

12、樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g）注意事項(xiàng)：茚三酮受陽(yáng)光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下： 取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過(guò)濾，將濾液放入冰箱中過(guò)濾，即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶，過(guò)濾，用2ml冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用。茚三酮顯色法測(cè)定氨基酸含量一、 目的 學(xué)習(xí)茚三酮顯色法測(cè)定氨基酸含量的方法二、 原理茚三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。氨與茚三酮和還原性茚三酮反應(yīng)，生成紫色化合物。該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過(guò)測(cè)定570nm處的光密度，測(cè)定氨基酸的含量。 三、 試劑與材料（1）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：配制成0.3mm

13、ol/L溶液。（2）pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液：量取86mL 2mol/L醋酸鈉溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH檢查校正。（3）茚三酮顯色液：稱(chēng)取85mg茚三酮和15mg還原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。茚三酮若變?yōu)槲⒓t色，則需按下法重結(jié)晶：稱(chēng)取5g茚三酮溶于1525mL熱蒸餾水中，加入0.25g活性炭，輕輕攪拌。加熱30min后趁熱過(guò)濾，濾液放入冰箱過(guò)夜。次日析出黃白色結(jié)晶，抽濾，用1mL冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器干燥后，裝入棕色玻璃瓶保存。還原型茚三酮按下法制備：稱(chēng)取5g茚三酮，用125mL沸蒸餾水溶解，得黃色溶液。將5g維生素C用250mL溫蒸餾水溶解，一邊攪

14、拌一邊將維生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不斷出現(xiàn)沉淀。滴定后繼續(xù)攪拌15min，然后在冰箱內(nèi)冷卻到4，過(guò)濾、沉淀用冷水洗滌3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，備用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去過(guò)氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亞鐵，振蕩12h，過(guò)濾除去硫酸亞鐵，再經(jīng)蒸餾，收集沸點(diǎn)為121125的餾分，為無(wú)色透明的乙二醇甲醚。（4）60乙醇。（5）樣品液：每毫升含0.550g氨基酸。（6）分光光度計(jì)。（7）水浴鍋。四、操作步驟1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別取0.3mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于試管中，用水補(bǔ)足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液；再加入1mL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100水浴中加熱15min，用自來(lái)水冷卻。放置5min后，加入3mL 60乙醇稀釋?zhuān)浞謸u勻，用分光光度計(jì)測(cè)定OD570nm。（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，應(yīng)測(cè)定OD440nm）。以O(shè)D570nm為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2氨基酸樣品的測(cè)定取樣品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液1mL和茚三酮顯色