植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)此生代謝產(chǎn)物

1、植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的應用摘要： 植物組織細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)應用最重要的一個方面，它是一個應用廣泛和快速發(fā)展的技術(shù)。植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)已應用于植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，并取得很大成效。本文講述組織細胞培養(yǎng)技術(shù)在藥物、食品、 化妝品等方面的次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的一些應用， 以及總結(jié)了現(xiàn)在主要植物組織培養(yǎng)技術(shù)、 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在實踐中的應用。關(guān)鍵詞 ： 次生代謝產(chǎn)物 細胞培養(yǎng) 代謝產(chǎn)物植物的次生代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)成分已被人類廣泛應用，主要集中在研究制藥 （ 如如抗癌藥物紫杉醇、療傷藥物紫草寧、保健藥物人參皂甙等） 、食品添加劑 （ 如生姜、香子蘭等 ） 、調(diào)味劑 （ 如胡椒、留蘭

2、香等） 、食用色素（ 如花青素等） 、油料 （ 如如豆寇油、春黃菊油等 ） 、飲料 （ 如咖啡、可可等） 、樹膠 （ 如阿拉伯膠等） 、化妝品、生物殺蟲劑和農(nóng)用化學品等方面。 盡管有些植物次生代謝物質(zhì)并不是很多， 但它們與人類健康密切相關(guān)，已成為當前生物領(lǐng)域研究關(guān)注的重點。 因此許多植物代謝產(chǎn)物以組織細胞培養(yǎng)技術(shù)的方法開發(fā)利用，進行大規(guī)模生產(chǎn)，使植物次生代謝物質(zhì)產(chǎn)量和活性提高。1 植物組織培養(yǎng)技術(shù)在實踐中的應用 121 世紀是生物技術(shù)迅速發(fā)展的世紀，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中的重要內(nèi)容，可以用于：植物育種 已被越來越廣泛的用于扦插難生根植物、引種材料少的植物。除常規(guī)的用器官進行培養(yǎng)，也可以

3、用花藥進行花粉單倍體植株育種，這種方法技術(shù)簡單，對一些植物種來說易于誘導未成熟花粉的分裂，可以進行大群體研究，可以迅速而大量的產(chǎn)生單倍體，具有迅速純合、選擇效率高、排除雜種優(yōu)勢干擾、突變體篩選、消除致死基因等優(yōu)點。用于脫毒和離體快繁獲得脫除病毒的材料和用于植物材料快速繁殖這方面是目前植物細胞組織培養(yǎng)應用最多最有效的一方面. 世界上受病毒危害的植物很多， 而園藝植物受病毒危害更為嚴重，當植物被病毒侵染后，常常造成生長遲緩、品質(zhì)變劣、產(chǎn)量大幅度降低等危害，目前，已經(jīng)在馬鈴薯、甘薯、草莓、大蒜、蘋果、香蕉等多種作物上大規(guī)模應用 ; 離體培養(yǎng)的優(yōu)點就是快速，而且材料來源單一，遺傳背景一致，不受季節(jié)和地

4、區(qū)的限制，重復性好，所以離體快速繁殖已經(jīng)廣泛應用于果樹，中藥材等的栽培。在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的應用 用單細胞或細胞團在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)， 此方法操作簡單、重復性好、群體大等優(yōu)點,利用植物細胞組織的大規(guī)模培養(yǎng)， 可以有效的生產(chǎn)各種天然化合物， 如生物堿、 蛋白質(zhì)、糖類、藥物、香料天然色素以及其他活性產(chǎn)物，已經(jīng)專利 100 多項。用于保存植物種質(zhì)資源及其交換植物種質(zhì)資源一方面不斷大量增加， 另一方面一些珍貴的、瀕危的的植物資源又日趨枯竭，造成田間保存耗資巨大，又可導致有益基因不斷喪失，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行離體低溫或冷凍保存，可大大節(jié)省人力物力及土地，可以挽救那些瀕危植物種、珍稀植物種。在遺傳、生理

5、、生化、病理等研究上的應用 已經(jīng)成為植物科學研究中的常規(guī)方法，在植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，發(fā)展出的一系列遺傳轉(zhuǎn)化、突變體篩選、基因轉(zhuǎn)移、DNAft接導入技術(shù)已成為基因工程的核心技術(shù)，組織培養(yǎng)也成為生物技術(shù)的重要組成部分。2 植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物在藥物生產(chǎn)方面的應用藥用植物次生代謝物種類繁多，化學結(jié)構(gòu)迥異?，F(xiàn)在已知大約有10000種次生代謝物，包括酚類、黃酮類、香豆素、木脂素、生物堿、糖苷、萜類、甾類、皂苷、多炔類、有機物等。組織培養(yǎng)技術(shù)應用在藥學方面的工作雖然歷史不長，但發(fā)展很迅速，它具有如下一些優(yōu)點：利用組織培養(yǎng)代替原植物的栽培以獲得所需的有效成份，達到產(chǎn)量高，成本低的目的，還可

6、節(jié)約土地。紫杉醇紫杉醇是用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、廣普而且作用機理獨特的抗癌藥物。近年來，臨床研究還表明，紫杉醇對其它病癥也有一定療效，如關(guān)節(jié)炎、先天性多囊腎病、早老性癡呆等2 。日本從短葉紅豆杉和東北紅豆杉中進行組織細胞培養(yǎng)獲得較高含量的紫杉醇細胞系植株。我國的研究人員經(jīng)過多年研究，利用細胞懸浮培養(yǎng)對多種紅豆杉不同外植體進行愈傷組織的誘導、 培養(yǎng)、 篩選出了紫杉醇高產(chǎn)細胞株， 并經(jīng)生物反應器擴大培養(yǎng)含量，細胞生長和紫杉醇含量都相當理想2 ，通過細胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)?；虡I(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的研究已取得了重大的進展。紫草寧 3紫草寧可以用作創(chuàng)傷、燒傷以及痔瘡的治療藥物。 1974 年， T

7、abata 等研究了在哪一種培養(yǎng)基上可使培養(yǎng)細胞產(chǎn)生紫草寧衍生物。 1981 年 Tabata 和 Fujita 等進行懸浮培養(yǎng)，并得到紫草寧衍生物。日本在1983 年也用大規(guī)模紫草細胞培養(yǎng)來生產(chǎn)紫草寧。國1986 年開始研究，得出在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，培養(yǎng)的紫草細胞懸浮無中紫草寧含量占干重的14%，比紫草根中含量高幾倍。食品生產(chǎn)方面的應用食品添加劑是食品工業(yè)的“靈魂” ，食用色素、香精香料、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑等既賦予了食品宜人的外觀、口感和滋味，又使其在銷售期內(nèi)保持了新鮮狀態(tài)。薄荷油 3目前已經(jīng)開始采用胡椒薄荷細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)工業(yè)薄荷油，但產(chǎn)量很低，這主要是因為菇烯單體的不穩(wěn)定性及植物毒

8、素的毒性作用而影響到薄荷油的合成。如今，胡椒薄荷中菇烯單體的合成途徑已經(jīng)基本確定。止匕外，在采用經(jīng)根癌農(nóng)桿菌T37轉(zhuǎn)化后的薄荷頂芽培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)薄荷油物質(zhì)的生物合成與菇烯類物質(zhì)有關(guān)，已測出菇烯類物質(zhì)是由葉部的油腺所分泌。這些發(fā)現(xiàn)必將促進工業(yè)薄荷油的生產(chǎn)。香蘭素 3香蘭素 （4- 羥基 -3- 甲基苯甲醛） 又稱香草酚，是香子蘭制品中的重要組成成分，香蘭素是世界上使用最廣的增香劑， 已被廣泛應用于冰淇淋、 飲料、 巧克力、 糖果、 布丁、焙烤食品以及酒類、香煙等食品工業(yè)中。 ，目前主要用于香蘭素生產(chǎn)的化學合成法存在許多弊端，采用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)香蘭素受到了廣泛的關(guān)注。研究表明，在香莢豆中的香味成分

9、主要是內(nèi)源糖苷前體在成熟過程中通過氧化酶的作用而形成的， 在組織細胞產(chǎn)香成分的培養(yǎng)過程中，一些關(guān)鍵的酶，如葡萄糖苷酶、多酚氧化酶、過氧化酶的活性都在培養(yǎng)末期達到最高，而且，不同組織器官的細胞培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝物的合成能力有所不同。在香莢蘭胚部組織中香蘭素生物合成能力最強。通過建立細胞懸浮培養(yǎng)及采用吸附劑如極性（ 親水性 ） 樹脂或木炭，能夠促進產(chǎn)量的提高 3 。美國已經(jīng)開始采用植物愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)香蘭素添加劑，生產(chǎn)成本比化學合成低很多。它是通過建立細胞懸浮培養(yǎng)物以及采取吸附劑來促進產(chǎn)量的提高?；ㄇ嗨?3花青素廣泛存在于各種植物物種中，主要集中于花，花尊及果實部分，呈現(xiàn)粉紅、紅、 紫及藍色，

10、用作食品添加劑可獲得誘人的自然的紅色。 隨著國際社會對健康的重視，很多合成色素因使用安全問題被禁用，低毒性的天然花青素就有著巨大的應用潛力。在1987 年與 1989 年 Iiker 和 Francis 建議將植物細胞培養(yǎng)的天然花青素產(chǎn)品制品作為合成花青素的替代產(chǎn)品。 有許多廠家和研究機構(gòu)從事從各種植物細胞中生產(chǎn)天然色素的生產(chǎn)研究，并取得很大的進展。 Harigae Yasushi 用選擇可見高產(chǎn)細胞團的方法，在MS培養(yǎng)基上挑選出繁殖快的高產(chǎn)花青素葡萄細胞系，在30L 的小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)，粗花青素產(chǎn)率達到 % ； Kobayashi ， Yashinori 等在光照條件下懸浮培養(yǎng)花青素的土當歸

11、細胞，在SOOLe酵罐中培養(yǎng)16d收獲細胞，細胞重量增加26倍，花青素產(chǎn)量5倍，占細胞干重的%。隨著研究工作的進一步深人，植物細胞培養(yǎng)花青素將進人工業(yè)化階段。目前已有報道的能生產(chǎn)花青素的植物有：大戟屬、翠菊屬、甜生豆、矢車菊屬、玫瑰花、紫菊屬、蘋果、葡萄、胡羅卜、野生胡羅卜、葡萄藤、土當歸、商陸、筋骨草屬、靶苔屬等。報道過的能用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的色素有胡羅卜素、葉黃素、單黃酮體等。在化妝品方面的應用 5植物的次生代謝產(chǎn)物是化妝品原料的重要來源， 在美國 CTFA（ 美國化妝品盥洗用品和香精協(xié)會 ） 化妝品原料手冊和日本功能性化妝品原料手冊中選用的植物提取物及代謝產(chǎn)物的數(shù)量都占有較大比例。紫草提

12、取物在化妝品中用作收斂劑， 1983 年日本三井石油化學公司采用兩步法培養(yǎng)紫草細胞， 成功實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 1984 年該公司和鐘紡公司利用紫草寧色素研制出了世界第一支生物口紅。人參提取液是一種皮膚細胞活化劑，可以應用于系列化妝品的生產(chǎn)， 日本電工公司自 20 世紀 80 年代末一直進行人參細胞大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。其他方面的應用茶樹次生代謝產(chǎn)物 6茶樹次生代謝產(chǎn)物如多酚類物質(zhì)、咖啡堿、茶氨酸和菇烯類物質(zhì)等不僅是重要的植物天然產(chǎn)物， 也是構(gòu)成茶葉滋味、 香氣的特征品質(zhì)成份， 可廣泛用于食品、 醫(yī)藥等行業(yè)。如何開發(fā)利用這些天然產(chǎn)物已成為近年茶葉科學研究的熱點領(lǐng)域之一。七十年代， 原蘇聯(lián)等科學家對茶愈

13、傷組織中酚類化合物及黃烷醇類含量隨生長而積累的規(guī)律及影響次生代謝產(chǎn)物形成的激素、前體及光等影響因素進行了研究。國內(nèi)研究起步較晚， 九十年代研究人員對適合于茶愈傷組織生長及兒茶素積累的培養(yǎng)基中無機及有機成分、激素含量、PH條件和品種間差異等內(nèi)容進行了研究；利用茶愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)茶氨酸的產(chǎn)量可達干重的20%；利用茶愈傷組織培養(yǎng)還可生產(chǎn)可可堿和咖啡堿。綜觀這些研究，發(fā)現(xiàn)利用茶愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是可行的，但茶愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)兒茶素的能力大幅度降低， 同時喪失了形成復雜的醋性兒茶素的能力； 不同培養(yǎng)方式、不同培養(yǎng)基條件對產(chǎn)量影響較大，有些細胞系的兒茶素含量已超過原材料，說明了篩選高產(chǎn)細胞系的可

14、能性；利用愈傷組織合成兒茶素的時間仍較長，固體培養(yǎng)條件下需六周才達到高峰，而懸浮培養(yǎng)則只需2025 天；有關(guān)茶愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的工藝學內(nèi)容的研究涉足較少。由此看來，利用茶愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)尚不具備條件，篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞系、提高次生物質(zhì)的產(chǎn)量是關(guān)鍵所在，而工藝學內(nèi)容的研究則是工廠化的前提。長春花 7長春花培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿長春花是夾竹桃科長春花屬植物。 20 世紀 50 年代人們發(fā)現(xiàn)其細胞和組織培養(yǎng)物中含有100 多種次生代謝產(chǎn)物，其中大多為生物堿。它們的天然含量較低，但具有很強的生物活性，是目前應用最廣的天然抗癌藥物之一。利用組織培養(yǎng)和細胞工程技術(shù)篩選高產(chǎn)細胞系

15、和用毛狀根的培養(yǎng)生產(chǎn)各種長春花生物堿成了目前研究的熱點。在細胞培養(yǎng)中加入前體物質(zhì)如馬錢子甙，誘導子如茉莉酮酸、甲殼質(zhì)、果膠酶等均能提高長春花次生代謝產(chǎn)物的積累量。 Zhao 等在培養(yǎng)長春花細胞的系統(tǒng)中加入KCl、甘露糖、前體物質(zhì)（琥珀酸色氨和色氨酸）和一些生物代謝調(diào)節(jié)物后，觀察到處理后細胞產(chǎn)生的長春花堿和西蘿芙木堿是未經(jīng)處理的 4 倍多。 目前對長春花生物堿的基本代謝模式已比較清楚，但是其中關(guān)鍵限速酶還在研究之中。研究色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶在長春花細胞合成吲哚類和喹啉類生物堿中的作用發(fā)現(xiàn)采用基因工程方式超量表達這兩種酶后，生物堿產(chǎn)量超過200 mg/L,表明這兩種酶對長春花生物堿合成速度的

16、重要性。近年來，毛狀根培養(yǎng)技術(shù)在植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的廣泛應用，使得長春花的毛狀根培養(yǎng)越來越多研究。3 植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)的展望現(xiàn)在主要植物組織培養(yǎng)技術(shù)8現(xiàn)在主要的植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究和應用得比較多的有以下方面：固定化培養(yǎng)技術(shù)植物細胞固定化是將植物細胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進行培養(yǎng)，并生產(chǎn)有用代謝物的技術(shù)。與懸浮培養(yǎng)相比，它具有提高反應效率、延續(xù)反應時間及保持產(chǎn)物生產(chǎn)的穩(wěn)定性等特點。兩相培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性有機物或者具有吸附作用的多聚物使培養(yǎng)體系分為上下兩相，細胞或組織在水相中生長和合成次生代謝物質(zhì)，次生代謝物質(zhì)分泌出后再轉(zhuǎn)移到有機相中，然后再從有機相分離植物次生代

17、謝物的技術(shù)，稱為兩相培養(yǎng)技術(shù)。反義技術(shù) 根據(jù)堿基互補原理，人工合成或生物體合成特定互補DNAg RNAt段，抑制或封閉某些基因表達的技術(shù)，通過此技術(shù)，可以將反義DNM RNAt段導入植物細胞， 使催化某一分支代謝的關(guān)鍵酶活性受抑制或加強，從而提高目的物的含量，同時抑制其他化合物合成。冠嚶培養(yǎng)技術(shù)利用根癌農(nóng)桿菌感染植物可以將Ti質(zhì)粒的T-DN*段(含有誘導冠嚶組織發(fā)生的 tms 基因和 tmr 基因 ) 整合進入植物細胞的基因組， 誘導細胞冠癭組織的發(fā)生。毛狀根培養(yǎng)技術(shù) 毛狀根是雙子葉植物各器官受發(fā)根土壤桿菌感染后產(chǎn)生的病態(tài)組織。感染過程中，發(fā)根農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒 T- DNA 轉(zhuǎn)移并整合到植物

18、基因組中。具有激素自養(yǎng)，增殖速度快，次級代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定等特點。添加誘導子或引導物技術(shù)誘導子是一種能引起植物過敏反應的物質(zhì)， 當它在與植物的相互作用時，能快速、高度專一和選擇性地誘導植物特定基因的表達，進而活化特定次生代謝途徑，積累特定地目的次生代謝物，從而提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。植物細胞懸浮培養(yǎng)生物反應器技術(shù)生物反應器技術(shù)具有很多優(yōu)點： 工作體積大、 單位體積生產(chǎn)能力高、物理和化學條件控制方便等。展望組織細胞培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)最重要的應用技術(shù)之一， 它是生物技術(shù)最直接的體現(xiàn)，它的快速發(fā)展和廣泛應用不斷促進了生物技術(shù)的發(fā)展和推動人類科學技術(shù)的前進，將更大的服務于人類。特別是植物組織細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用已經(jīng)取得很大成績，正在快速的