若用同一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因形成相同的四個(gè)黏性

1、基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法常州北郊高級(jí)中學(xué)（213031）陳佳昕電E-mail: chenjiaxin_417摘要:基因工程是現(xiàn)代生物科技專題的重要內(nèi)容，基因工程四部曲中的核心內(nèi)容是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，在構(gòu)建表達(dá)載體過程涉及的限制酶的種類以及篩選方法成為考試的熱點(diǎn)內(nèi)容。本文結(jié)合三道例題將限制酶的選擇和篩選方法結(jié)合在一起進(jìn)行比較分析。關(guān)鍵詞:限制酶 篩選1 單酶切及篩選若用同一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因形成相同的四個(gè)黏性末端，因而可能出現(xiàn)多種連接方式如質(zhì)粒和質(zhì)粒目的基因和目的基因質(zhì)粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接質(zhì)粒與目的基因的連接。質(zhì)粒與目的基因的連接又會(huì)出現(xiàn)

2、正向連接和反向連接兩種。若啟動(dòng)子在質(zhì)粒上，目的基因與質(zhì)粒的反向連接則導(dǎo)致三聯(lián)體密碼順序改變，起始密碼子和終止密碼子位置改變，使得翻譯不能正常進(jìn)行而無法得到正常的表達(dá)產(chǎn)物。例1: (2012江蘇生物高考33題部分)圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4種限制性核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。請(qǐng)回答下列問題 若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是 。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

3、經(jīng)檢測，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是 。答案: BamH I 抗生素B 同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反向鏈接筆者認(rèn)為可通過免疫學(xué)方法檢測目的基因的表達(dá)產(chǎn)物排除反向連接的重組質(zhì)粒，或分別在質(zhì)粒和目的基因上設(shè)計(jì)相同的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，然后用該酶去切割重組質(zhì)粒，正向連接和反向連接便會(huì)得到不同長度的DNA片段，再根據(jù)已知的限制酶在目的基因的位置進(jìn)行比對(duì)，找到正確連接的重組質(zhì)粒。2 雙酶切及篩選因?yàn)橛脝蚊盖袝?huì)出現(xiàn)質(zhì)粒與目的基因的任意連接，所以在實(shí)際操作中多使用雙酶切。雙酶切可以避免質(zhì)粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接和目的基因和質(zhì)粒的反向連接

4、，而目的基因與目的基因的連接因?yàn)闆]有抗生素抗性基因所以可以在含有該抗生素的培養(yǎng)基上去除，故只剩下質(zhì)粒與質(zhì)粒，以及質(zhì)粒與目的基因的重組體。2.1插入失活篩選法例2：（蘇錫常鎮(zhèn)2012屆高三教學(xué)調(diào)研測試）MseI，EcoRI，PstI識(shí)別的堿基序列和切割位點(diǎn)分別為GAATTAATTC，GAATTC，CTGCAG。請(qǐng)回答下列問題：1)在用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要對(duì)質(zhì)粒改造，構(gòu)建新的限制酶切位點(diǎn)。試寫出構(gòu)建需要的限制酶切位點(diǎn)的過程(提供構(gòu)建需要的所有條件)：首先用 酶處理質(zhì)粒；然后用DNA聚合酶等處理質(zhì)粒；再運(yùn)用 酶處理質(zhì)粒，從而形成新的限制酶切位點(diǎn)，可被 酶識(shí)別。(2)基因工程中的

5、檢測篩選是一個(gè)重要的步驟。下圖表示運(yùn)用影印培養(yǎng)法(使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法)檢測基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入大腸桿菌。PstIPst I 圖3培養(yǎng)基除了含有細(xì)菌生長繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有  ，   。從檢測篩選的結(jié)果分析，含有目的基因的是   菌落中的細(xì)菌。答案：（1)EcoRI，DNA連接，MseI(2)四環(huán)素 青霉素（四環(huán)素和青霉素）4和6用限制酶MseI和 PstI同時(shí)切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒，但原有質(zhì)粒上無MseI識(shí)別位點(diǎn)，需利用EcoRI識(shí)別位點(diǎn)重新構(gòu)建MseI識(shí)別位點(diǎn)。在抗青霉素基因內(nèi)部具有重新構(gòu)

6、建的MseI識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)用MseI和Pst I同時(shí)切割含目的基因的外源DNA和質(zhì)粒，由于目的基因的插入，導(dǎo)致抗青霉素基因出現(xiàn)功能性失活，于是所形成的重組質(zhì)粒都將具有四環(huán)素抗性和對(duì)青霉素敏感。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上，一段時(shí)間后可得到全部受體菌菌落，將滅菌的絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含青霉素的培養(yǎng)基上。含重組質(zhì)粒的受體菌能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長卻無法在青霉素培養(yǎng)基上上生長。上題實(shí)際是運(yùn)用插入失活1效應(yīng)檢測外源DNA。根據(jù)插入失活原理設(shè)計(jì)的篩選重組體分子的方法，需要進(jìn)行菌落平板的影印復(fù)制，才能識(shí)別出由此而喪失的表型特征，這會(huì)給重組體的篩選工作增加不少麻煩，由此而發(fā)

7、展出-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法1。2.2 -半乳糖苷酶顯色篩選法例3:（鹽城市2012屆高三二模）大腸桿菌pUCl8質(zhì)粒上的LacZ基囚可表達(dá)出-半乳糖苷酶，當(dāng)培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時(shí)，X-gal便會(huì)被-半乳糖苷酶水解成藍(lán)色，大腸桿菌將形成藍(lán)色菌落；反之，則形成白色菌落。由此推知，選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機(jī)鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加入 物質(zhì)。成功導(dǎo)人重組質(zhì)粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成  色的菌落，原因是 。 圖四選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機(jī)鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)外，還應(yīng)加入IPTG，X-gal和氨芐青霉素。只有導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長繁殖，而重組質(zhì)粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表達(dá)，所以無法表達(dá)-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基呈白色。答案：IPTG X-gal 氨芐青霉素：白色；重組質(zhì)粒中的LacZ基因因插入目的基因而不能表達(dá)3平端位點(diǎn)問題構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)常會(huì)出現(xiàn)平端位點(diǎn)，平端可用連接酶連接，平端連接可使載體和外源DNA連接序列上的原有限制位點(diǎn)消失，而不含外源插入