若用同一種限制酶切割質粒和目的基因形成相同的四個黏性

1、基因工程中限制酶的選擇及的篩選方法常州北郊高級中學（213031）陳佳昕電E-mail: chenjiaxin_417摘要:基因工程是現(xiàn)代生物科技專題的重要內容，基因工程四部曲中的核心內容是基因表達載體的構建，在構建表達載體過程涉及的限制酶的種類以及篩選方法成為考試的熱點內容。本文結合三道例題將限制酶的選擇和篩選方法結合在一起進行比較分析。關鍵詞:限制酶 篩選1 單酶切及篩選若用同一種限制酶切割質粒和目的基因形成相同的四個黏性末端，因而可能出現(xiàn)多種連接方式如質粒和質粒目的基因和目的基因質粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接質粒與目的基因的連接。質粒與目的基因的連接又會出現(xiàn)

2、正向連接和反向連接兩種。若啟動子在質粒上，目的基因與質粒的反向連接則導致三聯(lián)體密碼順序改變，起始密碼子和終止密碼子位置改變，使得翻譯不能正常進行而無法得到正常的表達產(chǎn)物。例1: (2012江蘇生物高考33題部分)圖2表示一種質粒的結構和部分堿基序列?，F(xiàn)有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4種限制性核酸內切酶，它們識別的堿基序列和酶切位點分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。請回答下列問題 若將圖2中質粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行連接，形成重組質粒，那么應選用的限制酶是 。在導入重組質粒后，為了篩選出含重組質粒的大腸桿菌，一般需要用添加 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

3、經(jīng)檢測，部分含有重組質粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達，其最可能的原因是 。答案: BamH I 抗生素B 同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質粒反向鏈接筆者認為可通過免疫學方法檢測目的基因的表達產(chǎn)物排除反向連接的重組質粒，或分別在質粒和目的基因上設計相同的限制酶識別位點，然后用該酶去切割重組質粒，正向連接和反向連接便會得到不同長度的DNA片段，再根據(jù)已知的限制酶在目的基因的位置進行比對，找到正確連接的重組質粒。2 雙酶切及篩選因為用單酶切會出現(xiàn)質粒與目的基因的任意連接，所以在實際操作中多使用雙酶切。雙酶切可以避免質粒的自身環(huán)化，目的基因的自身連接和目的基因和質粒的反向連接

4、，而目的基因與目的基因的連接因為沒有抗生素抗性基因所以可以在含有該抗生素的培養(yǎng)基上去除，故只剩下質粒與質粒，以及質粒與目的基因的重組體。2.1插入失活篩選法例2：（蘇錫常鎮(zhèn)2012屆高三教學調研測試）MseI，EcoRI，PstI識別的堿基序列和切割位點分別為GAATTAATTC，GAATTC，CTGCAG。請回答下列問題：1)在用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒時，需要對質粒改造，構建新的限制酶切位點。試寫出構建需要的限制酶切位點的過程(提供構建需要的所有條件)：首先用 酶處理質粒；然后用DNA聚合酶等處理質粒；再運用 酶處理質粒，從而形成新的限制酶切位點，可被 酶識別。(2)基因工程中的

5、檢測篩選是一個重要的步驟。下圖表示運用影印培養(yǎng)法(使在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法)檢測基因表達載體是否導入大腸桿菌。PstIPst I 圖3培養(yǎng)基除了含有細菌生長繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有  ，   。從檢測篩選的結果分析，含有目的基因的是   菌落中的細菌。答案：（1)EcoRI，DNA連接，MseI(2)四環(huán)素 青霉素（四環(huán)素和青霉素）4和6用限制酶MseI和 PstI同時切割含目的基因的DNA和質粒，但原有質粒上無MseI識別位點，需利用EcoRI識別位點重新構建MseI識別位點。在抗青霉素基因內部具有重新構

6、建的MseI識別位點，當用MseI和Pst I同時切割含目的基因的外源DNA和質粒，由于目的基因的插入，導致抗青霉素基因出現(xiàn)功能性失活，于是所形成的重組質粒都將具有四環(huán)素抗性和對青霉素敏感。將轉化的細菌接種在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上，一段時間后可得到全部受體菌菌落，將滅菌的絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含青霉素的培養(yǎng)基上。含重組質粒的受體菌能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長卻無法在青霉素培養(yǎng)基上上生長。上題實際是運用插入失活1效應檢測外源DNA。根據(jù)插入失活原理設計的篩選重組體分子的方法，需要進行菌落平板的影印復制，才能識別出由此而喪失的表型特征，這會給重組體的篩選工作增加不少麻煩，由此而發(fā)

7、展出-半乳糖苷酶顯色反應選擇法1。2.2 -半乳糖苷酶顯色篩選法例3:（鹽城市2012屆高三二模）大腸桿菌pUCl8質粒上的LacZ基囚可表達出-半乳糖苷酶，當培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal時，X-gal便會被-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌將形成藍色菌落；反之，則形成白色菌落。由此推知，選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質外，還應加入 物質。成功導人重組質粒的大腸桿菌在培養(yǎng)基中形成  色的菌落，原因是 。 圖四選擇培養(yǎng)基中除含有大腸桿菌必需的葡萄糖、氮源、無機鹽、水、生長因子等營養(yǎng)物質外，還應加入IPTG，X-gal和氨芐青霉素。只有導入質粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長繁殖，而重組質粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表達，所以無法表達-半乳糖苷酶，培養(yǎng)基呈白色。答案：IPTG X-gal 氨芐青霉素：白色；重組質粒中的LacZ基因因插入目的基因而不能表達3平端位點問題構建重組質粒時常會出現(xiàn)平端位點，平端可用連接酶連接，平端連接可使載體和外源DNA連接序列上的原有限制位點消失，而不含外源插入