大腸桿菌對恩諾沙星耐藥性研究

1、大腸桿菌對恩諾沙星耐藥性研究    英文題名 Studies on Persistence of E.coli to Enrofloxacin  關鍵詞 大腸桿菌; 耐藥性; 抗藥性; 外排泵; SOS應答; 英文關鍵詞 Escherichia coli; persistence; resistance; SOS reaction mechanism; efflux pump; 中文摘要 細菌對抗菌藥物產(chǎn)生抗藥性是獸醫(yī)臨床的常見現(xiàn)象,檢測臨床分離細菌的抗藥性可及時掌握細菌的抗藥趨勢,研究細菌抗藥機制可以為新藥物的開發(fā)及合理用藥提供理論支持。 本

2、文檢測了山東地區(qū)大腸桿菌藥敏情況并改進了藥敏試驗方法,建立了測定MPC的坡面平板法,研究了大腸桿菌對恩諾沙星的耐藥機制。 利用96點陣藥敏檢測盒檢測山東地區(qū)禽源和豬源大腸桿菌的抗藥性結(jié)果顯示：大腸桿菌呈現(xiàn)嚴重的多重抗藥性,多抗耐藥率超過90%,禽源性大腸桿菌抗藥性明顯高于豬源性大腸桿菌。 建立了坡面平板法,結(jié)果顯示坡面平板上的藥物濃度呈良好的梯度分布,可以把對藥物敏感性不同的細菌區(qū)分開。研究坡面平板上大腸桿菌的性質(zhì),發(fā)現(xiàn)高濃度藥物下生長大腸桿菌發(fā)生了基因突變,而低濃度藥物下生長的沒有發(fā)生基因突變。 利用基因芯片和實時熒光定量PCR研究恩諾沙星對大腸桿菌全基因表達譜的影響,結(jié)果顯示：(1)恩諾沙

3、星作用5h后,大腸桿菌519個基因出現(xiàn)表達差異,外排泵基因表達水平提高,外膜蛋白基因表達量急劇減少,恩諾沙星的靶酶parC基因表達量增加。說明細菌生理機制發(fā)生了廣泛而復雜的變化。(2)處理菌株的恩諾沙星靶酶沒有基因突變,提示低水平的細. 英文摘要 Resistance to antibiotic is inevitable for bacterium, we can know the resistance tendency of bacterium in time by testing drug sensitivity of pathogenic from clinical, it can&#

4、160; 摘要 4-5 Abstract 5 第一部分 文獻綜述 11-23     1 大腸桿菌耐藥性現(xiàn)狀 11-13     2 細菌耐藥性機理研究進展 13-16         2.1 抗菌藥物作用靶位改變 13-14         2.2 產(chǎn)生滅活酶 14         2.3 改變細菌外膜通透性 14-15 &#

5、160;       2.4 影響主動外排系統(tǒng) 15         2.5 形成細菌生物膜 15-16         2.6 細菌形態(tài)的變化 16     3 防突變濃度與突變選擇窗理論 16-18         3.1 MPC定義 16-18     

6、    3.2 MSW與MIC理論的區(qū)別 18     4 外排泵抑制劑 18-21         4.1 干擾外排泵組裝的外排泵抑制劑 19         4.2 阻斷外排泵能量來源的外排泵抑制劑 19-20         4.3 阻礙底物通過外排泵通道的外排泵抑制劑 20     

7、;    4.4 機制未知的外排泵抑制劑 20-21     5 研究目的和意義 21-23 第二部分 大腸桿菌的藥敏試驗 23-34     試驗一 山東地區(qū)動物源大腸桿菌藥敏檢測 24-30         1 材料與方法 24-26             1.1 試驗材料 24-25    

8、         1.2 大腸桿菌的分離鑒定 25             1.3 藥敏試驗 25-26         2 結(jié)果與分析 26-28             2.1 禽源大腸桿菌藥敏檢測結(jié)果 26-27  

9、;           2.2 豬源大腸桿菌藥敏結(jié)果 27-28         3 討論 28-29         4 小結(jié) 29-30     試驗二 吸管藥敏檢測盒的研制 30-34         1 材料與方法 30-32   

10、          1.1 材料 30             1.2 制備檢測盒 30-31             1.3 檢測盒的使用 31-32             1

11、.4 檢測盒效果驗證 32         2 結(jié)果與分析 32-33         3 討論 33         4 小結(jié) 33-34 第三部分 大腸桿菌對恩諾沙星耐藥機理研究 34-71     試驗一 坡面平板法的建立 35-43         1 材料與方法 35-37 &#

12、160;           1.1 材料 35             1.2 制定標準曲線 35-36             1.3 配制瓊脂塊 36           &

13、#160; 1.4 配制坡面平板 36             1.5 坡面平板各位置濃度分布與時間的關系 36             1.6 測定擴散濃度與配制濃度之間的關系 36-37             1.7 測定瓊脂塊中藥物回收率 37  &#

14、160;          1.8 坡面平板驗證 37         2 結(jié)果與分析 37-41             2.1 標準曲線 37             2.2 坡面平板表面藥物濃度 37-39

15、60;           2.3 不同配制濃度坡面平板表面藥物濃度 39-41             2.4 瓊脂中藥物回收率 41             2.5 坡面平板使用效果 41        

16、3 討論 41-42         4 小結(jié) 42-43     試驗二 坡面平板上大腸桿菌性質(zhì)的研究 43-47         1 材料與方法 43-44             1.1 試驗材料 43          &

17、#160;  1.2 配制坡面平板 43             1.3 細菌處理 43             1.4 擴增喹諾酮耐藥決定區(qū) 43-44         2 結(jié)果與分析 44-46         3 討論 46

18、         4 小結(jié) 46-47     試驗三 恩諾沙星對大腸桿菌基因組表達譜的影響 47-60         1 材料與方法 47-50             1.1 供試菌種 47           &

19、#160; 1.2 表達譜基因芯片 47             1.3 主要試劑與儀器 47-48             1.4 大腸桿菌生長曲線的測定與形態(tài)觀察 48             1.5 細菌總RNA提取 48    &#

20、160;        1.6 樣品RNA標記 48             1.7 雜交與清洗 48-49             1.8 芯片掃描與圖像采集 49             1.9

21、基因突變分析 49-50             1.10 數(shù)據(jù)分析 50         2 結(jié)果 50-56             2.1 大腸桿菌生長狀態(tài) 50-51            

22、2.2 總RNA電泳鑒定 51-52             2.3 表達譜基因芯片雜交與圖像采集 52             2.4 差異基因篩選 52-56             2.5 基因序列比對結(jié)果 56     &

23、#160;   3 討論 56-59             3.1 基因譜表達 56-59             3.2 基因序列比對 59         4 小結(jié) 59-60     試驗四 熒光定量測定大腸桿菌基因表達量 60-66  &#

24、160;      1 材料與方法 60-62             1.1 試驗儀器 60-61             1.2 細菌處理 61             1.3 提取供試大腸桿菌總RNA 61

25、60;           1.4 熒光定量PCR 61-62             1.5 結(jié)果處理 62         2 結(jié)果與分析 62-64             2.1 擴增曲線 62-63

26、            2.2 熔解曲線 63             2.3 基因數(shù)量 63-64         3 討論 64-65         4 小結(jié) 65-66     試驗五 外排泵與耐藥性的

27、關系 66-71         1 材料與方法 66-68             1.1 供試菌株 66             1.2 試驗器材 66-67             1.3 試劑

28、配制 67             1.4 測定菌體內(nèi)恩諾沙星達到穩(wěn)態(tài)的時間 67             1.5 外排泵檢測 67-68         2 試驗結(jié)果 68-69           

29、0; 2.1 菌體內(nèi)藥物達到穩(wěn)態(tài)所需時間 68             2.2 細菌外排泵檢測結(jié)果 68-69         3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻 72-82           &

30、#160; 1.2 試驗器材 66-67             1.3 試劑配制 67             1.4 測定菌體內(nèi)恩諾沙星達到穩(wěn)態(tài)的時間 67             1.5 外排泵檢測 67-68     &#

31、160;   2 試驗結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達到穩(wěn)態(tài)所需時間 68             2.2 細菌外排泵檢測結(jié)果 68-69         3 討論 69-70        

32、; 4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻 72-82             1.2 試驗器材 66-67             1.3 試劑配制 67             1.4 測定菌體內(nèi)恩諾沙星達到穩(wěn)態(tài)的時間 67   

33、60;         1.5 外排泵檢測 67-68         2 試驗結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達到穩(wěn)態(tài)所需時間 68             2.2 細菌外排泵檢測結(jié)果 68-69 &

34、#160;       3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻 72-82             1.2 試驗器材 66-67             1.3 試劑配制 67   

35、          1.4 測定菌體內(nèi)恩諾沙星達到穩(wěn)態(tài)的時間 67             1.5 外排泵檢測 67-68         2 試驗結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達到穩(wěn)態(tài)所需

36、時間 68             2.2 細菌外排泵檢測結(jié)果 68-69         3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻 72-82             1.2 試驗器材 66-

37、67             1.3 試劑配制 67             1.4 測定菌體內(nèi)恩諾沙星達到穩(wěn)態(tài)的時間 67             1.5 外排泵檢測 67-68         2

38、 試驗結(jié)果 68-69             2.1 菌體內(nèi)藥物達到穩(wěn)態(tài)所需時間 68             2.2 細菌外排泵檢測結(jié)果 68-69         3 討論 69-70         4 小結(jié) 70-71 結(jié)論 71-72 參考文獻 72-82             1.2 試驗器材 66-67     &