SDSPAGE 蛋白電泳分析

1、實(shí)驗(yàn)二 SDSPAGE 蛋白電泳分析一、 目的掌握 SDS-PAGE 電泳原理與方法二、 電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡(jiǎn)稱(chēng) Acr) 和交聯(lián)劑 N，N亞甲基雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng) Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。 SDS 是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其本身原

2、有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長(zhǎng)的函數(shù)。這種電泳方法稱(chēng)為 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡(jiǎn)稱(chēng) SDSPAGE）。由于 SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時(shí)蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計(jì)的程度，因此常用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么 SDSPAGE 后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。三、 試劑配制1 30% 丙烯酰胺：將 29g 丙烯酰胺和 1g N，N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為 6

3、0ml 的水中。加熱至 37溶解之，補(bǔ)加水至終體積為 100ml。用過(guò)濾器（0.45m 孔徑）過(guò)濾除菌，查證該溶液的 pH值應(yīng)不大于 7.0，置棕色瓶中保存于室溫 (丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過(guò)皮膚吸收，其作用具累積性。稱(chēng)量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料)。2 1M Tris-Cl: 稱(chēng)取 12.191g Tris 堿溶于 80ml 蒸餾水中，用濃 HCl 調(diào)到所需 pH 值，定容至 100ml。1.5M：Tris 堿 18.15g 去離子水 80ml 濃鹽酸調(diào) PH 值 8.8 加去離子水定容至 100

4、ml3 1 M DTT：稱(chēng)取 3.09 g DTT，加入到 50 ml 塑料離心管內(nèi)，加 20 ml 的 0.01 M NaOAc（pH5.2)，溶解后使用 0.22 mm 濾器過(guò)濾除菌適量分成小份后，-20保存。4 10% SDS: 20g SDS 溶于 200ml 純水中。5 10% 過(guò)硫酸銨：1g 過(guò)硫酸銨溶于 10ml 純水中，現(xiàn)用現(xiàn)配。6 2SDS 上樣緩沖液：1.0 mol/L Tris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS 40ml，50%甘油 40ml，0.2g 溴芬藍(lán)，定容至 100ml。7 10Tris-甘氨酸電泳緩沖液，3g Tris 堿和 18.8g 甘氨酸，加入

5、10ml 10%SDS，用去離子水補(bǔ)至100ml，配制成 10Tris-甘氨酸電泳緩沖液；取 50ml 10緩沖液，稀釋至 500ml，配制成工作濃度1Tris-甘氨酸電泳緩沖液。8 考馬斯亮藍(lán) R250 染色液：1gR250 溶于 250ml 異丙醇、100ml 冰乙酸和 650ml 去離子水的混合液中，過(guò)濾去除顆粒狀物。9 脫色液：乙醇/水/冰乙酸分別為 50ml,850ml 和 100ml。四、 實(shí)驗(yàn)方法110%分離膠的配制 7ml(小板為 5ml)：按附錄添加適量的試劑，立即倒膠，加水封膠待凝固。2吸干封液的水，倒?jié)饪s膠。3. 5%濃縮膠的配制 3ml：按附錄添加適量的試劑，立即倒膠，插入梳子待凝固。3取下梳子，用蒸餾水沖洗梳孔，洗凈其中的殘余膠塊，用濾紙吸干。4將制成的膠放入電泳槽內(nèi)，倒入 1甘氨酸電泳緩沖液，觀察不滲漏即可。5取 10l 樣品，加入等體積的 2SDS 上樣緩沖液，樣品與蛋白質(zhì) Maker 100保溫 5min。6 分別取 10l 上樣，110V 恒壓電泳 23 小時(shí)。7 將膠剝下至一平皿中，加入考馬斯亮藍(lán)染色 12 小時(shí)，回收染色