老鼠{對四氯化碳性致肝纖維化大鼠的治療機(jī)制研究

1、老鼠?對四氯化碳性致肝纖維化大鼠的治療機(jī)制研究                       作者：梅燕 林軍  侯軟玲 劉林【摘要】  目的研究老鼠?對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝組織腫瘤壞死因子（TNF-）、轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF1）與Smad3 mRNA表達(dá)的影響。方法Wistar大鼠隨機(jī)分成5組：空白對照組、模型對照組、秋水仙堿組、老鼠?乙醇浸膏低劑量

2、組和老鼠?乙醇浸膏高劑量組。除空白對照組外，其余4組用CCl4制備大鼠肝纖維化模型。秋水仙堿組、老鼠?乙醇浸膏低劑量組和老鼠?乙醇浸膏高劑量組分別于4周后給予相應(yīng)的藥物，空白對照組給予等容量的生理鹽水，1次/d。8周后處死大鼠，RT-PCR檢測肝組織中TNF-，TGF1 與Smad3 mRNA的表達(dá)。論文學(xué)術(shù)科研網(wǎng)結(jié)果與空白對照組相比，模型對照組TNF-，TGF1 與Smad3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)（0.23±0.18vs0.49±0.28，0.29±0.16vs1.79±2.13, 0.52±0.36vs0.99±0.53，P<0

3、.01）；老鼠?乙醇浸膏高、低劑量組（2.0，1.0 g?kg-1）較模型對照組TNF-，TGF1 與Smad3 mRNA表達(dá)減弱（1.0 g?kg-1：0.29±0.21vs0.49±0.28，0.62±0.44vs1.79±2.13, 0.59±0.34vs0.99±0.53，P<0.05；2.0 g?kg-1：0.16±0.13vs0.49±0.28，0.66±0.51vs1.79±2.13, 0.53±0.41vs0.99±0.53，P<0.05）。結(jié)論老

4、鼠?能夠抑制大鼠肝纖維化肝組織TNF-，TGF1 與Smad3mRNA的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  肝纖維化 老鼠? 腫瘤壞死因子 轉(zhuǎn)化生長因子1 Smad3老鼠?Acanthus ilicifolius Linnseus是一種生長在熱帶海岸地帶的紅樹林植物，屬爵床科（Acanthaceae）老鼠?屬Acanthus。老鼠?收錄于全國中草藥匯編，全株或根入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止咳平喘之功效，主治淋巴結(jié)腫大、急慢性肝炎、肝脾腫大、胃痛、咳嗽、哮喘1。    肝纖維化的形成機(jī)制是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成和降解失調(diào)。腫瘤壞死因子（TNF-）在肝纖維化始動激

5、活及調(diào)控中具有重要作用；轉(zhuǎn)化生長因子1（TGF1）是導(dǎo)致肝纖維化的最重要的細(xì)胞因子, 其作用的發(fā)揮和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad 密切相關(guān)。其中，Smad3是介導(dǎo)TGF1誘導(dǎo)肝纖維化的關(guān)鍵分子。本實驗觀察老鼠?治療大鼠實驗性肝纖維化的療效，研究大鼠肝組織TNF-、TGF1 與Smad3 mRNA的表達(dá)情況，探討老鼠?對大鼠肝纖維化的治療機(jī)制。1  材料1.1  動物清潔級Wistar大鼠60只，體重（180±20） g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1.2  藥品及配制老鼠?乙醇浸膏由本課題實驗組提取。取100 g老鼠?乙醇浸膏，用單蒸水配制成高劑量濃度

6、為0.2 g（相當(dāng)于生藥材46.60 g）?ml-1的藥液；取50 g老鼠?乙醇浸膏，用單蒸水配制成低劑量濃度為0.1 g?ml-1的藥液。 -4保存?zhèn)溆茫褂们皳u勻；秋水仙堿（西雙版納股份藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：060717），用單蒸水配制成濃度為0.040 mg?ml-1的藥液。1.3  試劑四氯化碳（上海化學(xué)試劑公司，批號20050393）。Trizol總RNA提取試劑盒（美國Invitrogen）；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas）；無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠，批號20070126）；三氯甲烷（重慶川江化學(xué)試劑廠，批號20070507），異丙醇（成都市科龍

7、化工試劑廠，批號20070418）。2  方法2.1  建立大鼠肝纖維化模型2及給藥方法60只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組、模型對照組、秋水仙堿組、老鼠?乙醇浸膏高劑量組和老鼠?乙醇浸膏低劑量組。每組12只。除了空白對照組外，其余各組大鼠第1次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.05 ml?kg-1，以后每周2次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.03 ml?kg-1?？瞻讓φ战M僅皮下注射等體積植物油。連續(xù)8周。在注射四氯化碳4周后，秋水仙堿組以0.4 mg?kg-1、老鼠?乙醇浸膏高、低劑量組分別以2.0，1.0 g?kg-1，用等容量給藥法按10 ml?kg

8、-1灌胃，1次/d。空白對照組和模型對照組給予等容量的生理鹽水。連續(xù)4周。2.2  標(biāo)本采集所有大鼠于第8周末處死，取肝左葉組織1塊，于-70保存。2.3  肝組織TNF-、TGF1 與Smad3 mRNA的表達(dá)測定Trizol提取大鼠肝組織總RNA，方法按試劑盒說明書操作，用紫外分光光度計測定RNA純度，按RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR分析TNF-、TGF1 與Smad3，-actin作為內(nèi)參。TNF-、TGF1 、Smad3和-actin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TNF-上游引物序列：5TGCCTCAGCCTCTT

9、CTCATT 3，下游引物序列： 5TGGTATGAAGTGGCAAATCG 3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為404bp；TGF1上游引物序列：5TACAGGGCTTTCGCTTCAGT 3，下游引物序列： 5TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為394bp；Smad3上游引物序列：5GCAGTGGCAATCACAGAGAA 3，下游引物序列： 5AACAGCCTGGGAGAGACTCA 3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為386bp；-actin上游引物序列：5AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG 3，下游引物序列： 5TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT 3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為240b

10、p。取5g總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)成cDNA。以cDNA為模板分別按以下條件PCR反應(yīng)擴(kuò)增TNF、TGF1 和Smad3片斷。TNF- PCR條件：94 4min 30s，9430s，5230s，72 1 min，30個循環(huán)，72 8 min；TGF1 PCR條件：94 4 min 30 s，9430 s，55 30 s，72 1 min，30個循環(huán)，72 8 min；Smad3 PCR條件：94 4 min30 s，94 30 s，53 30 s，72 1 min，30個循環(huán)，72 8 min。取5 l PCR產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠（含溴乙啶）上電泳，電泳條件：120V，20min，

11、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)采集圖像。以內(nèi)參-actin為基準(zhǔn)作半定量分析，以擴(kuò)增目的基因區(qū)帶的灰度值與內(nèi)參-actin區(qū)帶的灰度值之比確定各擴(kuò)增目的基因的相對表達(dá)水平。2.4  統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS13.0軟件分析，計量資料用±s表示，多樣本均數(shù)采用方差分析。P0.05表示差異有顯著性意義。3  結(jié)果3.1  肝組織總RNA的提取提取的總RNA通過測定OD260/OD280比值均介于1.72.0之間，表明各樣品RNA純度符合實驗要求。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察，未見RNA明顯降解。 學(xué)術(shù)科研網(wǎng)3.2  肝組織TNF-、TGF1 與Sm

12、ad3 mRNA的表達(dá)大鼠肝組織TNF- mRNA、TGF1mRNA、Smad3 mRNA均表達(dá)，見圖13。從表1可知，大鼠模型對照組與空白對照組的TNF-，TGF1 、Smad3 mRNA表達(dá)水平差異有顯著性（P0.01），表明TNF-，TGF1 、Smad3在肝纖維化大鼠肝臟大量表達(dá)；秋水仙堿組、老鼠?乙醇浸膏高劑量組、老鼠?乙醇浸膏低劑量組分別與模型對照組相比，差異有顯著性（P0.05），表明TNF-，TGF1 ，Smad3在各組中的表達(dá)均較模型對照組有所降低。圖1  肝組織TNF- mRNA的表達(dá)（略） 圖2  肝組織TGF1mRNA的表達(dá)（略）圖3

13、60; 肝組織Smad3 mRNA的表達(dá)（略）表1  老鼠?對肝纖維化大鼠肝臟TNF mRNA，TGF1 mRNA和Smad3 mRNA表達(dá)的影響（略）與空白對照組比較，*P<0.05，*P<0.01；與模型組比較，P<0.05,P<0.01；n=124  討論    肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，其主要機(jī)制是細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失調(diào)。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞，有多種細(xì)胞因子對HSC具有激活、增生及轉(zhuǎn)化的作用。    在肝纖維化過程中TNF-對HSC的

14、增殖、活化以及ECM的合成、基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑的釋放起重要作用。TNF能上調(diào)活化的HSC中蛋白水解酶抑制物的合成，從而抑制基質(zhì)的降解3。作為炎性細(xì)胞因子，TNF-刺激枯否細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子如TGF1等，形成正反饋的放大作用，產(chǎn)生更多的ECM4。TNF-主要是通過刺激肝臟炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生而發(fā)揮其促纖維化作用5。TNF-與肝纖維化有關(guān)的作用包括： 誘發(fā)急性炎癥過程；加強(qiáng)HSC的趨化性； 刺激間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂； 誘發(fā)蛋白多糖的合成。    研究表明ECM的合成與降解很大程度上由TGF1控制，TGF1突出作用是促進(jìn)膠原與細(xì)胞外基質(zhì)的形成，同時抑制其膠原酶的降解

15、。在TGF1作用下，HSC被激活或轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞6。激活的HSC自身也合成、分泌TGF1，HSC在自分泌和旁分泌的TGF1作用下大量活化，這種自分泌正反饋調(diào)節(jié)是肝纖維化得以發(fā)展的重要環(huán)節(jié)7。TGF1 對HSC 的活化信號必須經(jīng)過細(xì)胞膜相應(yīng)受體及其下游效應(yīng)分子如Smad 蛋白,啟動HSC細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。Smad蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的TGF家族受體激酶的關(guān)鍵作用底物8,是將配體與受體作用的信號由胞漿傳導(dǎo)到胞核的中介分子。Schnabl 等9報道，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中,有Smad蛋白的參與, 以Smad3 為代表的R-Smad分子傳遞的可能是致肝纖維化信號。Smad3是介導(dǎo)TGF-1誘導(dǎo)

16、肝纖維化的關(guān)鍵分子。TGF-1激活的肝星狀細(xì)胞主要表達(dá)Smad310。本研究顯示在肝纖維化模型組，Smad3表達(dá)升高，隨著用藥組的治療，Smad3表達(dá)減弱，表明Smad3參與調(diào)節(jié)膠原的轉(zhuǎn)錄。    本實驗研究結(jié)果顯示，老鼠?乙醇浸膏能抑制TNF-，TGF1 與Smad3 mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制HSC活化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減弱肝纖維化的程度。提示老鼠?乙醇浸膏可通過發(fā)揮對細(xì)胞因子TNF，TGF1 與Smad3的影響，減少由于CCl4染毒而導(dǎo)致肝內(nèi)膠原產(chǎn)生和沉積，在多個環(huán)節(jié)抑制肝纖維化的形成，從而為老鼠?防治肝纖維化提供了一定的實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1

17、 全國中草藥匯編編寫組. 全國中草藥匯編，下冊M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：231.2 徐叔云，卞如濂，陳 修藥理實驗方法學(xué)，第3版M北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1350.3 Knittel L, Tmehde M, Kobold D, et a1. Expression patterns of matrix metalloproteinase- es and their inhibitors in parenchymal and nonparencymal cells of rat liver：regulation by TNF-alpha and TGF-beta 1J. J

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