鋁對(duì)大鼠誘導(dǎo)性異位骨形成和礦化的作用及慢性腎功能不全對(duì)其作用

1、鋁對(duì)大鼠誘導(dǎo)性異位骨形成和礦化的作用及慢性腎功能不全對(duì)其作用的影響         09-08-11 08:35:00     作者：張義國王松鶴    編輯：studa20【摘要】  目的探討鋁對(duì)骨組織的毒性作用及機(jī)制。 方法采用不脫鈣骨切片技術(shù)，配合四環(huán)素雙標(biāo)記和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)，研究不同的鋁濃度及不同的腎功能對(duì)誘導(dǎo)性異位骨形成及礦化的影響。實(shí)驗(yàn)大鼠分為五組：對(duì)照組（C）；低劑量鋁組（LDA）；高劑量鋁組（HDA）；慢性腎

2、功能不全組（CRF）；慢性腎功能不全加高劑量鋁組（CRF+HDA）。 結(jié)果C組和LDA、CRF組之間無明顯不同。HAD組及CRF+HAD組骨組織內(nèi)四環(huán)素?zé)晒怆p標(biāo)線短、少，多為單標(biāo)線，且粗細(xì)不一、增寬、融合，表面有較多類骨質(zhì)沉積，尤以CRF+HAD組為甚。 結(jié)論(1)鋁可影響大鼠誘導(dǎo)性異位骨形成并阻礙其礦化作用，引起骨軟化。(2)慢性腎功能不全可加重鋁致骨軟化。 【關(guān)鍵詞】  鋁大鼠誘導(dǎo)性異位骨慢性腎功能不全骨軟化    【Abstract】ObjectiveTo explore the toxicity of aluminum to bone tissu

3、e.MethodsNon-decalcification sections with tetracycline double labeling and bone tissue metrology was used to study effects of different concentration aluminum on normal and chronic renal failure(CRF)rats.The experimental rats were randomized into 5 groups:control(C),low dose aluminum(LDA),high dose

4、 aluminum(HDA),CRF,CRF+HDA respectively.ResultsThere were no markedly differences between C,LDA and CRF group.Osteoid deposition on bone tissue surface was found with tetracycline fluorescence double labeling and bone tissue metrology in HDA and CRF+HDA group,especially in CRF+HDA group.ConclusionAl

5、uminum can influence ectopic ossification,obstruct mineral fixation and lead to osteomalacia in rats.Osteomalacia may deteriorate in rats with CRF.    【Key words】aluminum;rats;induced ectopic ossification;chronic renal failure;osteomalacia    1972年Reddi和Huggings1，2用同種脫鈣

6、骨基質(zhì)粉植入動(dòng)物皮下，建立誘導(dǎo)性骨形成的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?979年Oohire3等在此基礎(chǔ)上用骨基質(zhì)（bone-matrix gelatin）植入動(dòng)物皮下，不僅在活體組織內(nèi)有較強(qiáng)的誘導(dǎo)生骨能力，且在體外培養(yǎng)時(shí)，也能誘導(dǎo)培養(yǎng)的肌肉組織生成軟骨組織。近年來35人們利用此模型研究了藥物對(duì)誘導(dǎo)性骨形成的影響。我們采用BMG植入術(shù)，并用不脫鈣骨切片技術(shù)，配合四環(huán)素雙標(biāo)記法和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)，研究了不同劑量鋁及不同腎功能對(duì)誘導(dǎo)性骨形成和礦化的作用及影響，探討鋁對(duì)骨組織的毒性作用和機(jī)制。    1材料與方法    11BMG的制備  

7、  1.1.1儀器磁力攪拌器，恒溫箱，冰箱。    1.1.2試劑氯仿，甲醇，鹽酸，氯化鈣，EDTA。    1.1.3骨干骨制備骨基質(zhì)明膠的骨干骨來自成年SD大鼠的股骨及脛骨骨干。    1.1.4制備方法在相對(duì)無菌的條件下取出脛骨和股骨的骨干骨，除去骨干骨的骨髓和附著軟組織。骨干骨用蒸餾水沖洗后，在磁力攪拌器的攪拌下作如下順序處理：（1）室溫下氯仿:甲醇（1:1）1h；（2）水洗；（3）2下0.6mol/L鹽酸24h（中間換鹽酸1次）；（4）水洗（使終末水洗液的pH達(dá)中性）；（5）2下2mo

8、l/L氯化鈣1h；（6）水洗；（7）2下0.5mol/L EDTA（用NaOH調(diào)pH值至7.4）1h；（8）水洗；（9）2下8mol/L鹽酸1h；（10）水洗；（11）55滅菌蒸餾水1h；（12）冰凍干燥（或放入液氮內(nèi)凍干）后轉(zhuǎn)入-20冰箱中保存。    1.2植入術(shù)將制備好的圓筒狀BMG放入生理鹽水內(nèi)浸濕并復(fù)溫，用剪刀沿其縱向劈成兩半，在半圓的兩個(gè)長邊上剪成交錯(cuò)的槽口，以擴(kuò)大可接觸的面積。將BMG分別植入雄性幼鼠的胸部兩側(cè)肌肉內(nèi)，每側(cè)植入兩個(gè)長約0.71cm的半圓筒。    1.3動(dòng)物分組3840天SD系雄性幼鼠100只，作為植入受

9、體，將其分為五組：(1)C組：僅植入BMG不給鋁，腹腔內(nèi)注生理鹽水1ml；(2)LDA組：植入BMG并腹腔內(nèi)注入硫酸鋁分子0.2mg/只；(3)HAD組：植入BMG并腹腔內(nèi)注入硫酸鋁分子2mg/只；(4)CRF組：不給鋁，僅腹腔注入生理鹽水1ml；(5)CRF+HAD組：植入BMG并腹腔注入硫酸鋁2mg/只。以上各組均腹腔內(nèi)注入5次/周。腎功能不全按文獻(xiàn)報(bào)告的方法，先將左腎2/3切除，1周后行右腎全切除術(shù)。實(shí)驗(yàn)中LDA組注硫酸鋁總量為6mg,HDA組注硫酸鋁總量為60mg。    1.4四環(huán)素雙標(biāo)記法注射用鹽酸四環(huán)素按25mg/kg皮下注射，第1次和第2次標(biāo)記分別

10、在注鋁后33天和38天（間隔5天）進(jìn)行。43天處死動(dòng)物。    1.5血清鋁及骨鋁測(cè)定取各組大鼠血清及股骨下段剝除軟組織待檢。濕樣品在6070烘干，取0.20.3g樣品加入1:5的高氯酸:硝酸4ml消化至近干。轉(zhuǎn)移至10ml比色管用1%HNO3進(jìn)行稀釋后，用日產(chǎn)Z-8000原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。    1.6取材及組織處理植入后第7、10、15、20天分別取出各組兩只大鼠體內(nèi)植入物，中性甲醛固定，石蠟包埋切片，光鏡觀察。各組大鼠在誘導(dǎo)成骨43天后處死，取其BMG誘導(dǎo)物，剝除軟組織浸入Villanueva骨染色劑內(nèi)4天。此后依次用乙醇

11、、丙酮脫水、脫酯，塑料包埋劑包埋。每個(gè)包埋劑在Jung ModelK德國產(chǎn)切片機(jī)上制備不脫鈣骨切片，15m厚用于熒光標(biāo)記觀察，10m厚用于鋁染色。    1.7骨組織形態(tài)計(jì)量各組每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，所得數(shù)據(jù)先作方差分析，如有顯著性再進(jìn)行兩側(cè)t檢驗(yàn)。    1.7.1雙標(biāo)間距（m）用測(cè)微尺測(cè)量四環(huán)素雙標(biāo)線間距離，求均值（本實(shí)驗(yàn)此參數(shù)可動(dòng)態(tài)反映誘導(dǎo)成骨第3338天的代謝情況）。    1.7.2平均礦化沉積率（m/d）用雙標(biāo)間距除以雙標(biāo)間隔的時(shí)間（5天）求出。    1.7

12、.3初鋁礦化寬度（m） 用測(cè)微尺測(cè)量第2次標(biāo)記線與類骨質(zhì)間礦化骨寬度，求均值（本實(shí)驗(yàn)參數(shù)可反映誘導(dǎo)骨第3843天的骨質(zhì)形成及礦化）。    1.7.4初始礦化沉積率（m/d）由初始礦化寬度除以二標(biāo)至取材所間隔的時(shí)間（5天）求出。    1.7.5類骨質(zhì)寬度（m）用測(cè)微尺測(cè)量誘導(dǎo)性新骨尚未礦化部分寬度，求均值。    1.7.6礦化延遲時(shí)間（d）以類骨質(zhì)的平均寬度除以平均礦化沉積率。    1.7.7視野內(nèi)四環(huán)素?zé)晒馀c方格鏡交點(diǎn)數(shù)分別記錄每個(gè)視野內(nèi)的四環(huán)素?zé)晒馀c方格鏡交點(diǎn)數(shù)，取

13、均值（交點(diǎn)數(shù)多少可反映成骨活動(dòng)的活躍與否。本實(shí)驗(yàn)參數(shù)反映了誘導(dǎo)成骨第43天的情況）。     09-08-11 08:35:00     作者：張義國王松鶴    編輯：studa20    2結(jié)果    2.1血清鋁、骨鋁變化各組大鼠血清鋁、骨鋁的測(cè)定見表1。表1各組大鼠血清鋁及骨鋁含量（每組5只大鼠平均值 從表1可以看出血清鋁、骨鋁含量呈現(xiàn)與注射劑量一致的顯著差異。實(shí)驗(yàn)各組大鼠的成骨過程，是在體內(nèi)不同的血清鋁濃度

14、作用下完成的。    22各組大鼠成骨及礦化情況注鋁后43天，誘導(dǎo)性骨組織在熒光顯微鏡下的變化在C組與LDA組、CRF組之間無明顯不同。此時(shí)沿骨小梁表面可見清晰的四環(huán)素雙標(biāo)線，并覆蓋有新生的尚未礦化的類骨質(zhì)。HDA組及CRF+HDA組骨組織內(nèi)四環(huán)素?zé)晒怙@示的部位較少，少見雙標(biāo)線多為單標(biāo)線，且標(biāo)志線粗細(xì)不一、有的增寬，融合，表示礦化障礙，在四環(huán)素標(biāo)志線表面可見大量類骨質(zhì)沉積，尤以CRF+HDA組為甚，表明骨質(zhì)形成及礦化嚴(yán)重受阻。各組大鼠誘導(dǎo)成骨的骨質(zhì)形成和礦化情況可用骨計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)分析來表示，見表2。表2不同鋁劑量對(duì)不同腎功能大鼠骨質(zhì)形成和礦化影響的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參

15、數(shù)注：三個(gè)加鋁組與對(duì)照組比較，*P0.05；*P0.001；三個(gè)加鋁組之間比較，P0.001    正常時(shí)，骨質(zhì)形成和礦化過程二者速率應(yīng)保持一致。從表2可以看出C、LDA、CRF組誘導(dǎo)性骨質(zhì)成骨量（視野內(nèi)四環(huán)素?zé)晒夥礁窠稽c(diǎn)數(shù)）顯著高于HDA、CRF+HDA組。HDA、CRF+HDA組所出現(xiàn)的骨質(zhì)減少、礦化速率變慢、礦化延遲時(shí)間加長以及所形成的骨質(zhì)中類骨質(zhì)增寬都很明顯，說明已呈現(xiàn)骨軟化。    2.3骨鋁染色按Maloneg法6進(jìn)行未脫鈣骨鋁染色，見鈣化骨及類骨質(zhì)之間有紅色條索，且粗細(xì)不一，顯示骨鋁染色陽性。  &#

16、160; 3討論    誘導(dǎo)性異位成骨經(jīng)早期的軟骨內(nèi)化骨過程，到2131天左右已形成骨組織。鋁對(duì)此期的成骨和礦化有何影響，目前未見有關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)采用四環(huán)素雙標(biāo)法對(duì)誘導(dǎo)成骨過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析表明：C、LDA、CRF組的誘導(dǎo)成骨和礦化作用無明顯改變。HDA、CRF+HDA組此時(shí)已有明顯的骨質(zhì)形成及礦化障礙，尤以CRF+HDA組表現(xiàn)得更為明顯。說明高鋁尤其是慢性腎功能不全時(shí)給予高鋁可嚴(yán)重抑制成骨細(xì)胞功能，使成骨及礦化嚴(yán)重受阻，以致給鋁后43天四環(huán)素?zé)晒馀c方格鏡交點(diǎn)數(shù)顯著減少，導(dǎo)致骨軟化的發(fā)生。誘導(dǎo)成骨鋁染色顯示鋁位于類骨質(zhì)及礦化骨之間，提示鋁可以阻礙類骨質(zhì)礦化。

17、0;   各組大鼠血清鋁、骨鋁含量與給鋁的劑量多少、不同的腎功能情況呈顯著差異。其中HDA、CRF+HDA組血清鋁及骨鋁含量最高，顯示高劑量給鋁和慢性腎功能不全都是引起鋁致骨毒性作用的兩個(gè)始動(dòng)因素，且后者起促進(jìn)及加重作用。建議臨床上對(duì)腎功能不全的病人要減少或避免鋁鹽的攝入，以免引起中毒性鋁骨病。提議有關(guān)鋁廠對(duì)職業(yè)性骨病病人進(jìn)行血清鋁、骨鋁測(cè)定及不脫鈣骨切片檢查，以便早期發(fā)現(xiàn)和診斷鋁骨病，探討并制定鋁骨病的防治措施。【參考文獻(xiàn)】  1Urist MR, Delange RJ,Finerman GAM. Bone cell differentiation and gr

18、owth factors. Science, 1983,220:686.2Urist MR, Jwata H, Delange PL,et al. Bone morphogenesis in implants of insoluble bone gelatin. Proc Nat Acad Sci USA, 1973,70(12):3511.3Jian-Min Zhu,Huffer W,Allen CA. Effect of aluminum on bone matrix inductive properties. Kidney Int,1990,18:1141.4Okamoto.Muscle tissue reactons to implantation of bone matrix gelatin. Clinical Orthopaedics and Related Research, 1991,263:242.5Boyce BF,by