高效液相色譜固定相和流動(dòng)相

1、高壓液相色譜 HPLC培訓(xùn)教程（六）IV 固定相和流動(dòng)相 在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計(jì)算機(jī)實(shí) 現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu)化的任務(wù)之一。本章著重討論填料基質(zhì)、化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及其選擇。一、基質(zhì)（擔(dān)體）HPLC 填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機(jī)物基質(zhì)，也可以是有機(jī)聚合物基質(zhì)。無機(jī)物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無 機(jī)物基質(zhì)剛性大， 在溶劑中不容易膨脹。 有機(jī)聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯 - 二乙烯苯、 聚甲基丙烯酸酯。 有機(jī) 聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機(jī)基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，結(jié)果減少傳質(zhì)，最終使柱 效降低。1基質(zhì)的種類1

2、）硅膠硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強(qiáng)度外，還提供一個(gè)表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上 各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極 性和非極性溶劑。缺點(diǎn)是在堿性水溶性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為28。硅膠的主要性能參數(shù)有： 平均粒度及其分布。 平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。 比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。 含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。 含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越

3、強(qiáng)，對溶質(zhì)的吸附作 用越大。 端基圭寸尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。 幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透 性差；后者無此缺點(diǎn)。 硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。2）氧化鋁具有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。不過現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并 顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。3）聚合物以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC它們的壓力

4、限度比無機(jī)填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng) 堿來清洗色譜柱。 甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙烯 -二乙烯苯疏水性更強(qiáng)， 但它可以通過適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬?成親水性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯 -二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復(fù)沖洗。所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢， 所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性 基質(zhì)。因

5、此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。2基質(zhì)的選擇硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。二、化學(xué)鍵合固定相將有機(jī)官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學(xué)鍵合相。這類固定 相的突出特點(diǎn)是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類型來改變分離的選擇性。1鍵合相的性質(zhì)目前，化學(xué)鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應(yīng)，形成 Si-O-Si-C 鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個(gè)/nm2,由于空間位阻效

6、應(yīng)（不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有4050%的硅醇基未反應(yīng)。殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對 極性溶質(zhì) （特別是堿性化合物） 產(chǎn)生次級化學(xué)吸附， 從而使保留機(jī)制復(fù)雜化 （使溶質(zhì)在兩相間的平衡速度減慢， 降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要 用三甲基氯硅烷（TMCS）等進(jìn)行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping ），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些 ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動(dòng)相有更好的”濕潤性能。由于

7、不同生產(chǎn)廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應(yīng)條件不同，因此具有相同鍵合基團(tuán)的鍵合相，其表面有機(jī)官能團(tuán)的鍵合量往往差別很大，使其產(chǎn)品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量（C%）來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。pH 值對以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應(yīng)在 pH=28的介質(zhì)中使用。2鍵合相的種類化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。常用的極性鍵合相主要有氰基 (-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極性鍵合基團(tuán)與

8、溶質(zhì)分子間的氫鍵作用，極性強(qiáng)的組分保留值較大。極 性鍵合相有時(shí)也可作反相色譜的固定相。常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1C18)和苯基、苯甲基等，以 C18應(yīng)用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈 烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，并常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化 合物時(shí)可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似。另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長的烷基鏈保護(hù)了硅膠基質(zhì)的緣故，但C18基團(tuán)空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時(shí)柱效較低。3固定相的選

9、擇分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化 合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力，對某些多官能團(tuán)化合物如甾體、強(qiáng)心甙等 有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分 析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因?yàn)樗鼈冎g會發(fā)生反應(yīng)生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術(shù)，例如反相離子抑制技術(shù) 和反相離子對色譜法等， 非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。O

10、DS(octadecyl silane) 是應(yīng)用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物 的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。 另外，美國藥典對色譜法規(guī)定較嚴(yán)，它規(guī)定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細(xì)，這樣使色譜 圖易于重現(xiàn)；而中國藥典僅規(guī)定填料種類，未規(guī)定柱的長度和粒度，這使檢驗(yàn)人員難于重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)，在某些情況 下還浪費(fèi)時(shí)間和試劑。三、流動(dòng)相1流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。 選好填料(固定相)后，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應(yīng)的容量因子k 降低

11、；而較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面吸附增加，相應(yīng)的容量因子k升高。因此，k值是流動(dòng)相組成的函數(shù)。塔板數(shù)N般與流動(dòng)相的粘度成反比。所以選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面： 流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會溶脹或收 縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸 附劑的柱系統(tǒng)。 純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。 必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以

12、提高靈敏度。 粘度要低(應(yīng)2cp)。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時(shí)間延 長。最好選擇沸點(diǎn)在 100C以下的流動(dòng)相。 對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。 樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。2流動(dòng)相的選擇在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng) 而增加；在反相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。 極性調(diào)整劑

13、的性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下， 甲醇- 水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求， 且流動(dòng)相粘度小、 價(jià)格低， 是反相色譜最常用的流動(dòng)相。 但 Snyder 則推薦采用 乙腈-水系統(tǒng)做初始實(shí)驗(yàn)， 因?yàn)榕c甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小， 并可滿足在紫外185205nm處檢 測的要求，因此，綜合來看，乙腈 -水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇 -水系統(tǒng)。在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)，為了使各組分均有合適的k 值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。反相色譜中，如果要在相同的時(shí)間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇 / 水作為沖洗劑時(shí)其沖洗強(qiáng)度配比與乙腈 /水或 四氫呋喃 / 水的沖洗強(qiáng)度配

14、比有如下關(guān)系：C 乙腈=0.32C 2甲醇+ 0.57C甲醇C 四氫呋喃=0.66C甲醇C 為不同有機(jī)溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強(qiáng)度相當(dāng)于 89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃 /水的沖洗強(qiáng)度。3 流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸(3 pKaW 7)或弱堿(7W pKaW 8)樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的 pH值，以抑制樣 品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動(dòng)相的 pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的 pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相 反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用5

15、0mmol/L 磷酸鹽緩沖液和 1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和 30mmol/L三乙胺溶液。注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在 這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。4流動(dòng)相的脫氣HPLC 所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣， 否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡， 影響泵的工作。 氣泡還會影響柱的分離效率， 影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流 動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會引起溶劑pH

16、 的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時(shí)造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況 下，熒光響應(yīng)可降低達(dá) 95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮

17、 發(fā)造成的組成變化。 超聲脫氣比較好， 1020分鐘的超聲處理對許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑 /水混合液的脫氣是足 夠了（一般500ml溶液需超聲2030min方可），此法不影響溶劑組成。 超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部 或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在14 小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴 入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出 來。此外

18、還有在線脫氣機(jī)。一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這 種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。5流動(dòng)相的濾過所有溶劑使用前都必須經(jīng) 0.45µm （或 0.22µm ）濾過， 以除去雜質(zhì)微粒， 色譜純試劑也不例外 （除非在標(biāo)簽上標(biāo)明 已濾過 ）。用濾膜過濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過濾 有機(jī)溶劑，過濾水溶液時(shí)流速低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會被 溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC對于混合流動(dòng)相，可在混合前分

19、別濾過，如需混合后濾過，首選有機(jī)相濾膜?，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。6流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3 天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì) 沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。7鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCI4、CHC13等）與各種醚類（如乙醚、二異丙