雙酚A對(duì)小鼠生殖內(nèi)分泌影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、    雙酚A對(duì)小鼠生殖內(nèi)分泌影響的實(shí)驗(yàn)研究作者：杜鵑,胡淼,崔克勤    作者單位：吉林醫(yī)藥學(xué)院勞動(dòng)與環(huán)境教研室，吉林 吉林 132013； 北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011.【摘要】  目的 觀察雙酚A對(duì)小鼠生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。 方法 小鼠經(jīng)不同劑量的雙酚A染毒3d后，用紫外分光光度法檢測(cè)睪丸組織中乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性；放射免疫法測(cè)定血清雌二醇(E2)、睪丸組織內(nèi)睪酮(T)水平。 結(jié)果 各染毒組LDH活性、T含量均明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，

2、且隨著染毒劑量的增加而明顯降低；4mol/kg組G-6-PD活性較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。雄性和雌性小鼠血清E2濃度隨染毒劑量的增加而逐漸升高，當(dāng)劑量達(dá)到80mol/kg時(shí)，明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。 結(jié)論 雙酚A對(duì)小鼠具有一定的生殖內(nèi)分泌毒性?！娟P(guān)鍵詞】  雙酚A(BPA) 生殖 內(nèi)分泌 睪丸 酶學(xué) 激素Experimental observation on the impact of BPA on reproductive endocrine system of mice.DU Juan, HU Miao, CUI Ke-qin.(Departmen

3、t of Labor and Environment of Jilin Medical and Pharmaceutical College, Jilin 132013, Jilin,P. R.China)    Abstract：Objective  To observe the effects of BPA on the reproductive endocrine system of mice.  Methods  Tthree days after  treatment of mice treated with di

4、fferent doses of BPA, the activities of LDH and G-6-PD in the testis of mice were determined with spectrophotometry. The level of estradiol in serum and testosterone in testis of mice was determined with RIA.  Results  The LDH activity and T level in mice treatment with different doses of

5、BPA were significantly lower than that in the control group (P<0.05),and it decreased along with the increasing of the BPA dose. The activity of G-6-PD in the mice of 4mol/kg group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). E2 concentration in serum of male and female in

6、creased along with the increasing of the BPA dose. When the BPA dose reached 80mol/kg, E2 concentration was significantly higher than that in the  controls (P<0.05).  Conclusion  BPA can affect the reproductive and endocrine system of mice.    Key words：BPA；Reproduct

7、ion；Endocrine；Testis; Enzymology；Hormones雙酚A(Bisphenol A BPA)化學(xué)名4-二羥基二苯基丙烷, 分子量228，白色晶體，低等毒性，結(jié)構(gòu)與雌激素類似，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確的一種激素活性物質(zhì)1。它被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)碳酸聚酯、聚苯乙烯樹脂、塑料制品等工業(yè)產(chǎn)品中，可通過(guò)食品包裝容器或塑料薄膜滲入食品或飲料而進(jìn)入體內(nèi)，干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)，對(duì)人體產(chǎn)生有害作用2。目前國(guó)內(nèi)對(duì)BPA的研究多集中于其雌激素樣作用上，而對(duì)BPA的生殖內(nèi)分泌毒性研究還比較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同劑量BPA染毒后小鼠體內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性變

8、化和生殖內(nèi)分泌激素雌二醇(E2)、睪酮(T)水平的改變，以探討B(tài)PA對(duì)小鼠生殖內(nèi)分泌的毒性作用。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  昆明種小鼠50只，體重(25±2)g，雌雄各半，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2  染毒藥品制備  BPA溶于丙酮后，用色拉油稀釋，配成濃度分別為0.5mol/ml、2.5mol/ml、5mol/ml、10mol/ml的溶液，4冰箱保存。1.3  儀器和試劑  752型紫外分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠)；電動(dòng)組織勻漿器(江蘇省東臺(tái)縣安豐電器廠)；MTX-150低溫高速

9、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FJ-2008免役計(jì)數(shù)儀(國(guó)營(yíng)二六二廠)；雙酚A(上?；瘜W(xué)試劑公司)；還原型輔酶(NADH)(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)；氧化型輔酶鈉鹽(NADP+)(Sigma公司)；葡萄糖-6-磷酸鈉鹽G-6-P(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)；雌二醇(E2)放射免疫分析試劑盒(中國(guó)原子能研究院)；睪酮(T)放射免疫分析試劑盒(北京北免東雅生物技術(shù)研究所)。1.4  實(shí)驗(yàn)方法  按隨機(jī)分組的原則，將小鼠分為5組，每組10只，雌雄各半。設(shè)陰性對(duì)照組(色拉油)和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組BPA劑量分別為4mol/kg、20mol/kg、40mol/kg、80mol

10、/kg。各組動(dòng)物按0.8ml/100g體重腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射3d，給藥期間每日稱重，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥量。第4d將動(dòng)物處死。1.5  觀察指標(biāo)1.6  統(tǒng)計(jì)方法  采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均用表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。2  結(jié)果2.1  BPA對(duì)小鼠睪丸酶活性的影響  各染毒組LDH活性均明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且隨著染毒劑量的增加而明顯降低；G-6-PD活性4mol/kg組較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，其余各染毒組與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05

11、),見(jiàn)表1。2.2  BPA對(duì)小鼠生殖內(nèi)分泌激素的影響  雄性小鼠血清中雌二醇濃度4mol/kg和20mol/kg組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，80mol/kg組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；雌性小鼠血清中雌二醇濃度40mol/kg和80mol/kg組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。各染毒組睪丸組織中睪酮含量明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且隨著染毒劑量的增加而逐漸降低，但各染毒組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05),見(jiàn)表1。表1  不同劑量BPA對(duì)小鼠睪丸酶活性和內(nèi)分泌激素的影響（略）注:*與對(duì)照組比較，P<0.05。3

12、  討論    近年來(lái)，環(huán)境化學(xué)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)日益引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注。大量調(diào)查資料表明環(huán)境中存在多種能夠模擬和干擾動(dòng)物及人類內(nèi)分泌機(jī)能的物質(zhì)，其中模擬雌激素作用的化學(xué)物最多，人們將這一大類具有雌激素樣作用的化學(xué)物稱為環(huán)境雌激素。它們能夠模擬或干擾機(jī)體內(nèi)天然雌激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、排泄、生理作用等，從而影響生殖系統(tǒng)發(fā)育，破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡3。雙酚A是酚類化合物中有代表性的環(huán)境污染物，其類雌激素活性在國(guó)外已有報(bào)道，國(guó)內(nèi)也已經(jīng)有人指出其對(duì)雄性哺乳類生殖系統(tǒng)具有影響4。3.1  BPA小鼠睪丸酶活性的影響  睪丸乳酸脫氫酶(LDH)

13、是由生精細(xì)胞產(chǎn)生的，在初級(jí)精母細(xì)胞的減數(shù)分裂、分化的能量代謝過(guò)程中起著重要作用，并和生精上皮的成熟有關(guān)5，LDH的含量和活性的動(dòng)態(tài)變化是生殖毒性的敏感指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中，各劑量組的BPA均能引起雄性小鼠睪丸LDH活性降低(P<0.05)，提示低劑量的BPA即可能對(duì)生精細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致LDH分泌減少或活性降低，進(jìn)而阻礙生殖細(xì)胞的能量供給，逐漸導(dǎo)致生殖細(xì)胞變性。    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)存在于生精小管的間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和精原細(xì)胞內(nèi)，尤以間質(zhì)細(xì)胞中活性最強(qiáng)，可作為反映間質(zhì)細(xì)胞功能的指標(biāo)5。本實(shí)驗(yàn)中，G-6-PD活性4mol/kg組較對(duì)照組明

14、顯升高(P<0.05)，其余各染毒組與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。提示可能在低劑量染毒時(shí)，生精細(xì)胞受到損傷，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞的能量代謝活動(dòng)代償性的增強(qiáng)，從而使G-6-PD活性增加，用以協(xié)助恢復(fù)生精細(xì)胞功能。而當(dāng)染毒劑量逐漸升高時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞也受到損傷，使其能量代謝活動(dòng)受到抑制，進(jìn)而使G-6-PD活性難以提高而處于停滯狀態(tài)。3.2  BPA對(duì)小鼠生殖內(nèi)分泌激素的影響  雌二醇(E2)是體內(nèi)生物效能最強(qiáng)的雌激素，雄性體內(nèi)的E2主要來(lái)源于睪丸支持細(xì)胞，而雌性體內(nèi)的E2是由卵巢內(nèi)優(yōu)勢(shì)卵泡或黃體分泌而來(lái)6。環(huán)境雌激素BPA的結(jié)構(gòu)與E2相似，都具有兩個(gè)芳香環(huán)，引起雌激

15、素活性的羥基取代位置也相同。因此，一方面BPA可以與E2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體(ER)，表現(xiàn)出雌激素拮抗作用。另一方面，BPA可與E2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合血漿性激素結(jié)合蛋白(SHBG)，雖然正常人血漿中環(huán)境雌激素與SHBG的親和力較低，但其可置換與SHBG結(jié)合的內(nèi)源性性激素，增加血漿中游離態(tài)T和E2的濃度6。本實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠不同劑量的BPA后，雄性和雌性小鼠血清中的E2濃度逐漸升高，當(dāng)染毒劑量達(dá)到80mol/kg時(shí)，明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)?？赡苁且?yàn)楫?dāng)BPA濃度較高時(shí)，可與E2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER , 導(dǎo)致血漿E2濃度升高，并且高濃度的BPA與E2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SHBG，置換與SHBG結(jié)合的內(nèi)源

16、性性激素，增加血漿中游離態(tài)E2濃度。    睪酮(T)是由位于睪丸小葉曲細(xì)精管之間的間質(zhì)細(xì)胞以膽固醇為原料合成的，經(jīng)支持細(xì)胞進(jìn)入曲細(xì)精管后與雄激素結(jié)合蛋白(ABP)形成復(fù)合物，將T運(yùn)載到精原細(xì)胞和精母細(xì)胞上，然后釋放T使其進(jìn)入靶細(xì)胞，促進(jìn)精子發(fā)生。其次，T通過(guò)負(fù)反饋環(huán)路抑制垂體分泌間質(zhì)細(xì)胞刺激素(LH)，從而參與“下丘腦垂體睪丸軸”中生殖激素的調(diào)節(jié)與控制。本實(shí)驗(yàn)中，給予小鼠不同劑量的BPA后，各染毒組睪丸組織中T含量明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，且隨著染毒劑量的增加而逐漸降低，說(shuō)明BPA可抑制間質(zhì)細(xì)胞對(duì)T的分泌。這一方面可能是因?yàn)锽PA直接對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞功能下降，T分泌減少。另一方面可能是BPA通過(guò)對(duì)下丘腦垂體睪丸軸的影響使其分泌的促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)減少，從而影響了LH對(duì)睪丸中T合成的調(diào)節(jié)作用，使得T分泌減少。    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙酚A對(duì)小鼠具有一定的生殖內(nèi)分泌毒性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Sohoni P.Several environmental cestrogens are also