人大隱靜脈器官培養(yǎng)內(nèi)膜增生形態(tài)學(xué)研究

1、    人大隱靜脈器官培養(yǎng)內(nèi)膜增生形態(tài)學(xué)研究        【摘要】目的觀察人大隱靜脈在器官培養(yǎng)條件下是否發(fā)生內(nèi)膜增生。方法取30條人大隱靜脈段進(jìn)行器官培養(yǎng)14d，冰凍切片，蘇木素-伊紅(HE)、彈性纖維染色以及抗-肌動(dòng)蛋白(-actin)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色，與不培養(yǎng)的對(duì)照組進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)比較。結(jié)果培養(yǎng)14d后內(nèi)膜顯著增厚，增厚內(nèi)膜層中細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，增殖率為45%。結(jié)論體外培養(yǎng)的人體大隱靜脈將出現(xiàn)內(nèi)膜增生。內(nèi)膜增生是由于中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜層的移

2、行和增生，這與人大隱靜脈旁路移植術(shù)后病理改變相同。【關(guān)鍵詞】人大隱靜脈；器官培養(yǎng)；內(nèi)膜增生 Morphologic studies on endometrial hyperplasia of human saphenous vein in organ cultureWANG Yuqi, DAI Wangde, FU Weiguo, et al. Research Unit of Vascular Surgery, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China【Abstract】 Objective

3、 To investigate endometrial hyperplasia of human saphenous vein under the condition of organ culture. Methods Thirty saphenous vein segments were cultured for 14 days, frozen in liquid nitrogen and processed for Harris' hematoxylin and eosin and miller's elastic stain, as well as immunohisto

4、chemistry. Immunostaining of the frozen sections was performed with monoclonal anti-smooth muscle -actin and anti-PCNA antibody. Freshly excised vein segments were processed similarly as a control group. Results Human saphenous vein intimal thickness was increased significantly after cultured for 14

5、 days. The cells within neointima were smooth muscle cells (SMCs) with the proliferating index of SMCs within neointima being 45 %. Conclusion Endometrial hyperplasia of human saphenous vein in the organ culture might result from migration of medial SMCs into the intima and from proliferation.【Key w

6、ords】 Human saphenous vein; Organ culture; Endometrical hyperplasia為探討人靜脈內(nèi)膜增生的發(fā)生機(jī)理，Soyombo等1于1990年建立了人大隱靜脈器官培養(yǎng)內(nèi)膜增生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。我們?duì)其加以改進(jìn)，使方法更簡(jiǎn)便易行，觀察到了同樣的內(nèi)膜增生，現(xiàn)報(bào)道如下。材料與方法1.材料：(1)組織轉(zhuǎn)送液配制：RPMI1640+20mmol/L HEPES+4000IU/L肝素+5mg/L二性霉素B。(2)組織清洗液配制： RPMI1640+20mmol/L HEPES+2.5mg/L慶大霉素+100mg/L青、鏈霉素+0.8mmol/L谷氨酰胺。(3)

7、組織培養(yǎng)液配制：RPMI 1640+2g/L NaHCO32培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)14d，培養(yǎng)液23d更換1次。所有標(biāo)本液氮保存?zhèn)溆谩?.檢測(cè)指標(biāo)及方法：(1)冰凍切片：液氮保存標(biāo)本在LEICA CM1902恒冷箱切片機(jī)冰凍切片，片厚5m，切片置于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，干燥后用體積分?jǐn)?shù)為100%丙酮固定5min備用。(2)常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)和彈力纖維染色：每個(gè)靜脈連續(xù)3張切片染色，用像分析系統(tǒng)對(duì)每張切片上不同3點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)膜厚度測(cè)定。(3)抗平滑肌-肌動(dòng)蛋白(-actin)的單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色：冰凍切片固定后按免疫組織化學(xué)常規(guī)處理。TBS洗5min×3次。然后滴加體積分?jǐn)?shù)為0.

8、3%H2O2甲醇，室溫下30min；TBS洗5min×3次，清洗后加120正常羊血清，室溫保持15min以阻斷非特異反應(yīng)；加特異性一抗(抗平滑肌-actin的單抗)37 60min后TBS浸洗5min×3次。再加1200稀釋的酶標(biāo)二抗，37 30min后TBS浸洗5min×3次，用ABC在37反應(yīng)30，TBS浸洗5min×3次，DAB溶液顯微鏡下控制顯色，在出現(xiàn)強(qiáng)的特異性顯色而背景基本不著色時(shí)終止顯色反應(yīng)，蘇木素鹽酸復(fù)染，脫水，透明后用中性樹膠封片。顯色鏡下呈棕褐色標(biāo)記的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。(4)PCNA免疫組織化學(xué)分析：冰凍切片免疫組織化學(xué)分析步驟同上，

9、第一特異性單抗用鼠抗人PCNA單克隆抗體，核染色呈棕褐色者為增殖期細(xì)胞。(5)UEA-1親合免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)染色：冰凍切片常規(guī)處理后在生物素結(jié)合的UEA-1中浸育60min，TBS染滌后再與ABC試劑浸育，DAB鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，再脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察呈棕褐色標(biāo)記的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。(6)內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡觀察：標(biāo)本在4下用體積分?jǐn)?shù)為2%戊二醛磷酸緩沖液(pH7.4)固定24h后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%餓酸固定2h，然后梯度乙醇脫水和臨界點(diǎn)干燥噴金，在掃描電鏡下比較培養(yǎng)前后內(nèi)皮細(xì)胞變化。結(jié)果1.內(nèi)皮細(xì)胞活力和表面形態(tài)：用臺(tái)盼藍(lán)染色和掃描電鏡觀察準(zhǔn)備培養(yǎng)和培養(yǎng)14d后的內(nèi)膜面完

10、整性。準(zhǔn)備培養(yǎng)的靜脈臺(tái)盼藍(lán)著色部位靠近切口邊緣，掃描電鏡顯示內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整，有連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞層，靜脈邊緣細(xì)胞形態(tài)多變，有完整的內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)，也有內(nèi)皮細(xì)胞剝脫后內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)暴露的區(qū)域。培養(yǎng)14d后的靜脈內(nèi)膜面無(wú)臺(tái)盼藍(lán)染色，掃描電鏡顯示中心區(qū)域與剛分離時(shí)相似，細(xì)胞間常有較大間隙。為進(jìn)一步鑒別和定位內(nèi)皮細(xì)胞，橫斷面切片用UEA-1進(jìn)行親合免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)染色。新鮮靜脈在未著色的中層上有1層內(nèi)皮細(xì)胞單層，在中間部分是連續(xù)的，周圍部分有間隙。培養(yǎng)后的靜脈片內(nèi)膜面主要由內(nèi)皮細(xì)胞組成，間或有未著色細(xì)胞。2.內(nèi)膜厚度和細(xì)胞成分：培養(yǎng)前后的靜脈片冰凍切片HE、彈力纖維染色后進(jìn)行像分析，測(cè)定各組內(nèi)膜厚度。培養(yǎng)前內(nèi)膜

11、厚度為(3.5±2.0)m(n=30)，培養(yǎng)后內(nèi)膜厚度為(47.0±9.3)m(n=30)，培養(yǎng)前后內(nèi)膜厚度之間的差異有非常顯著性(P0.01)。切片抗平滑肌-actin的單抗免疫組織化學(xué)染色，培養(yǎng)后靜脈片增厚內(nèi)膜中細(xì)胞成分標(biāo)記為棕褐色，證明為平滑肌細(xì)胞。而新鮮靜脈切片中，大多數(shù)中層細(xì)胞標(biāo)記顯示為平滑肌細(xì)胞，很多未標(biāo)記的細(xì)胞在外膜層中，而內(nèi)膜層中沒有標(biāo)記的細(xì)胞。PCNA免疫組織化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)14d后靜脈新內(nèi)膜中的平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核增殖抗原染色陽(yáng)性，染色率達(dá)45%，表明增厚內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞增生活躍。討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大隱靜脈離體培養(yǎng)14d后均發(fā)生內(nèi)膜增生，增厚的內(nèi)膜是由中

12、層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜層移行和增殖而成。我們?cè)诖四Ｐ椭杏^察到的平滑肌細(xì)胞移行和增生現(xiàn)象的機(jī)理可能為：(1)已知內(nèi)皮細(xì)胞能通過(guò)分泌功能抑制或促進(jìn)內(nèi)膜增生的因子調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的移行和增生2。如果在培養(yǎng)條件下這種內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的抑制因子產(chǎn)生減少，而促進(jìn)內(nèi)膜增生的因子增加，靜脈管壁內(nèi)膜局部?jī)?nèi)皮源性生長(zhǎng)因子相對(duì)濃度則高，就產(chǎn)生了濃度梯度。內(nèi)膜局部抑制內(nèi)膜增生因子濃度降低，促進(jìn)內(nèi)膜增生因子濃度則增加，引起中層平滑肌沿濃度梯度向內(nèi)膜層移行和增生。這可能是平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜移行和增生的原因。(2)有實(shí)驗(yàn)證明，中層平滑肌細(xì)胞相互之間的接觸或與細(xì)胞外基質(zhì)成分的接觸可抑制平滑肌細(xì)胞的分裂增生2。靜脈移植后以及器官培養(yǎng)時(shí)靜脈內(nèi)膜面這種抑制作用可能下降，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜移行和增生?；痦?xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(39670685)作者單位：王玉琦（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）代望德（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）符偉國(guó)（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）姚秀玲（200032上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院血管外科研究室）參考文獻(xiàn)1，Soyombo AA, Angelini GD, Bryan AJ, et al. Intimal proliferation in an organ culture of human saphe