體外生物人工肝系統(tǒng)對暴發(fā)性肝衰竭兔的支持作

1、體外生物人工肝系統(tǒng)對暴發(fā)性肝衰竭兔的支持作【摘要】目的探討培養(yǎng)肝細胞用于生物人工肝及其作為肝移植輔助支持手段的可能性。方法以培養(yǎng)人肝細胞和中空纖維反應(yīng)器為主要材料構(gòu)成體外生物人工肝系統(tǒng)，對D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭(FHF)兔進行人工肝支持實驗。結(jié)果盡管兩組實驗動物的存活時間沒有明顯差異，但支持治療組兔的血清轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和肌酐水平均低于對照組，肝組織病理檢查見肝細胞壞死程度明顯輕于對照組，實驗所用肝細胞保持較好的活力和貼壁能力。結(jié)論所用體外生物人工肝支持系統(tǒng)已發(fā)揮出培養(yǎng)肝細胞的生物作用，能夠部分代償FHF兔的肝臟功能。【關(guān)鍵詞】人工肝支持暴發(fā)性肝衰竭兔Effect of extrac

2、orporeal bioartificial liver support system on fulminant hepatic failure in rabbits WANG Yingjie, LI Mengdong, WANG Yuming, et al. Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038【Abstract】ObjectiveTo evaluate the possibility of using cultured human hepatocytes as a bioartific

3、ial liver, which is used as an adjuvant support in liver transplantation. MethodsThe experiment of extracorporeal bioartificial liver support system (EBLSS) based on cultured human hepatocytes and a hollow fiber bioreactor was carried out on fulminant hepatic failure (FHF) in rabbits induced by D-ga

4、lactosamine. ResultsThere was no difference in survival time between the experimental and control groups of rabbits, but in the supported rabbits significantly lower serum alanine aminotransferase, total bilirubin, creatinine and markedly milder hepatocyte necrosis than those in control animals were

5、 observed. In addition, good viability of human liver cells was noted in the experiment. ConclusionThese data indicate that this EBLSS has played the biologic role of cultured human hepatocytes, and would be capable of partly compensating the function of the FHF liver.【Key words】Artificial liverLive

6、r supportFulminant hepatic failureRabbit近年來新一代生物型人工肝的研究取得重大進展，有望成為肝衰竭患者等待肝移植的輔助手段，受到學(xué)者們的普遍關(guān)注1。但國內(nèi)這一領(lǐng)域的研究尚未見報道。本研究在高密度培養(yǎng)肝細胞的基礎(chǔ)上，用培養(yǎng)的肝細胞、生物反應(yīng)器及輔助裝置構(gòu)成體外生物人工肝支持系統(tǒng)(EBLSS)，并用暴發(fā)性肝衰竭(FHF)動物模型進行初步實驗，現(xiàn)報道如下。材料與方法一、實驗動物：日本大耳白兔，體重23kg，性別不限，由本校實驗動物中心提供。二、兔FHF模型的制備：參照Blitzer等2介紹的方法，用D-氨基半乳糖(D-Gal，購自重慶醫(yī)科大學(xué))致死性劑量(1.

7、2g/kg)耳緣一次性注射制備兔FHF模型。三、FHF兔的人工肝支持：1.EBLSS細胞材料為混合球形聚集培養(yǎng)的人胎肝細胞和肝非實質(zhì)細胞，量約1108個，培養(yǎng)兩天后用于EBLSS。中空纖維型生物反應(yīng)器管內(nèi)腔容量約20ml，管外容量約24ml，中空纖維有效交換面積112.8cm2。使用Millipore超濾裝置為輔助循環(huán)系統(tǒng)，系統(tǒng)管道及反應(yīng)器內(nèi)腔預(yù)沖肝素液，并用輸液加熱器控制溫度在3739。2.體外循環(huán)通道的建立實驗前3648小時，戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈注射麻醉動物，股動、靜脈插入醫(yī)用F4號導(dǎo)管，約至髂外動、靜脈處，縫合肌肉皮膚，包扎固定肢體，肝素堵管。3.體外循環(huán)及觀察指標檢查兔股動、靜

8、脈插管通暢后，于體外循環(huán)前4小時制備FHF模型。隨后另選健康兔，頸動脈插管放血灌入EBLSS管道內(nèi)(量約30ml)，連接EBLSS與FHF兔動、靜脈插管，建立體外閉路循環(huán)，以1520ml/分鐘循環(huán)血液?？鼓齽楦嗡?，首劑150u/kg，維持量50u/kg，一次/30分鐘。循環(huán)過程中定時由反應(yīng)器外腔開口輸注肝細胞培養(yǎng)上清液，每只約15ml。定時采兔血置CX-7 Beckman生化分析儀檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TB)和肌酐變化，并取肝組織行病理檢查。四、EBLSS循環(huán)后肝細胞活力觀察：以0.01%胰酶和0.1mmol/L的EDTA消化分離、分散聚集人胎肝細胞和肝非實質(zhì)細胞，臺盼藍拒染試

9、驗測定細胞活力。采用置被覆膠原培養(yǎng)板、24小時常規(guī)條件培養(yǎng)法，觀察聚集肝細胞的貼壁能力。結(jié)果一、FHF兔存活時間：對照組5只FHF兔的存活時間分別為9.2、14.6、15.7、24.2、34.1小時，平均(19.69.7)小時。EBLSS支持組FHF兔中，1只意外死于EBLSS循環(huán)開始僅10分鐘，其余4只死亡時間分別為11.4、14.9、24.2、25.1小時，平均(18.96.8)小時。由死亡時間看EBLSS支持組存活時間并未較對照組延長(P0.05)。二、FHF兔主要生化指標的變化：動態(tài)檢測兩組FHF兔血清部分生化指標變化發(fā)現(xiàn)，兩組動物的ALT、TB、肌酐濃度在模型制備后10小時均逐漸升高

10、，但兩組相差尚不十分顯著。10小時以后，對照組兔ALT、TB和肌酐水平升高幅度加大，而同時相EBLSS支持組存活兔三項生化指標的增幅相對較小(13)。1實驗FHF兔血清ALT變化2實驗FHF兔血清TB變化3實驗FHF兔血清肌酐變化三、兩組FHF兔肝組織病理改變：5只對照組兔的肝組織病理改變均呈典型的急性肝壞死特征，主要表現(xiàn)為：肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失、肝索解離、肝細胞呈大片溶解性壞死、匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤。人工肝支持組，除1例病理改變見大塊肝壞死外，其余4只均表現(xiàn)為嚴重肝細胞變性、肝索排列紊亂、局灶性壞死，易見肝細胞再生現(xiàn)象(雙核細胞增多)。四、EBLSS循環(huán)過程肝細胞活力變化：FHF兔人工支持

11、實驗后，EBLSS所用肝細胞的活力和球形體肝細胞重新貼壁率較實驗前均有所降低。其中，肝細胞活力平均下降13.1%，肝細胞重新貼壁率下降26.2%。討論目前公認，肝移植是FHF的最有效療法，但由于受自身病情和供體來源的限制，多數(shù)FHF患者難以在有限的時間內(nèi)接受緊急肝移植。為此，國外學(xué)者長期致力于人工肝研究，以期做為等待肝移植的過渡支持手段。然而，早期的血液灌流、吸附等非生物型人工肝并未取得令人滿意的結(jié)果。直至晚近，以培養(yǎng)肝細胞為主要材料的EBLSS的出現(xiàn)才給該領(lǐng)域的研究帶來新的希望。越來越多的研究資料顯示3，這種新型生物人工肝支持系統(tǒng)不僅具有肝特異性解毒代謝功能，而且具有生物合成功能，可為FHF

12、患者等待肝移植創(chuàng)造條件，爭取時間。本研究在體外兩步法分離獲取高活性的人肝細胞后，采用綜合限制貼壁技術(shù)加以高密度球形聚集培養(yǎng)4，隨后置于中空纖維型生物反應(yīng)器，構(gòu)成簡易EBLSS，對D-Gal誘導(dǎo)的FHF模型兔進行人工肝支持研究，生化分析顯示，生物人工肝支持組動物的ALT、TB、肌酐的升高幅度得到一定的抑制，同時見支持組兔肝組織病理改變明顯較輕，并有不同程度的肝細胞再生，提示EBLSS對D-Gal誘導(dǎo)的FHF動物有一定的支持作用。結(jié)合EBLSS體外功能評價結(jié)果(另文報道)分析，該保護作用既包括了培養(yǎng)肝細胞對D-Gal及誘導(dǎo)肝損害后所產(chǎn)生毒性代謝物的解毒作用，又有肝細胞及肝細胞培養(yǎng)上清液提供肝細胞再

13、生物質(zhì)、促進肝細胞再生的作用。只因?qū)嶒瀯游矬w外循環(huán)難度較大、實驗條件不易控制、EBLSS對兔血液動力學(xué)影響過大而使EBLSS應(yīng)有的支持治療作用未能充分顯現(xiàn)。注：本課題為國家“九五”攻關(guān)項目作者單位：王英杰李夢東王宇明陳國致劉國棟譚朝霞（400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院）參考文獻1Gerlach J, Ziemer R, Neuhaus P. Fulminant liver failure: relevance of extracorporeal hybrid liver support systems. Int J Artif Organs, 1996, 19: 7-13.2Blitzer BL, Waggoner JG, Jones EA, et al. A moldel of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology, 1978, 74: 664-671.3Hoffman A